Pemerhatian spesimen biologi oleh JEM-1400Flash ー Aliran dari penyediaan sampel ke pemerhatian ー

Pengenalan

Menggunakan mikroskop elektron membolehkan pemerhatian struktur mikro dalam sel yang tidak boleh dilakukan dengan mikroskop optik. Untuk memahami struktur terperinci organel seperti mitokondria dan kloroplas, mikroskop elektron ialah alat yang berkuasa. Walau bagaimanapun, dengan TEM, pemerhatian spesimen dalam keadaan hidup tidak mungkin kerana pemerhatian dilakukan dalam vakum. Selain itu, agar pancaran elektron dihantar, spesimen perlu dihiris nipis.
Untuk tujuan ini, penyediaan spesimen adalah langkah yang sangat penting untuk memahami struktur sasaran tanpa artifak. Nota aplikasi ini menerangkan aliran penyediaan sampel untuk spesimen biologi, menggunakan contoh tisu tumbuhan untuk memperkenalkan data yang diperolehi oleh JEM-1400Flash.

Aliran penyediaan spesimen

Terdapat pelbagai kaedah dalam menyediakan spesimen biologi. Sebagai contoh, kami memperkenalkan penetapan spesimen dengan menggunakan kaedah penetapan kimia dan kaedah pembahagian ultra-nipis dengan menggunakan ultramikrotome. Proses penyediaan spesimen mengikut urutan ini: 1. Pemotongan spesimen, 2. Penetapan, 3. Dehidrasi, 4. Penggantian, 5. Benam, 6. Pempolimeran, 7. Pemangkasan, 8. Pembahagian ultra-nipis, 9. Pewarnaan. Setiap proses diterangkan di bawah.

1. Pemotongan spesimen

Spesimen dipotong menjadi kepingan kecil menggunakan pisau cukur, supaya bahan kimia yang akan digunakan dalam pemprosesan selanjutnya mudah meresap.

2. Penetapan

Satu proses untuk menghentikan perubahan struktur spesimen biologi dengan hanya beberapa artifak. Untuk penetapan kimia, penetapan dilakukan dua kali: awalan dan pasca penetapan. Prefiksasi digunakan untuk membetulkan protein, dan postfixation digunakan untuk menetapkan lipid.
Nota: Osmium tetroxide sangat meruap dan reaktif, serta boleh merosakkan sistem pernafasan, kulit dan membran mukus pengguna. Jadi, proses itu perlu dilakukan dalam makanan wasap.

Reagen

• Penyelesaian awalan：2.5 % glutaraldehid dan 2 % paraformaldehid dalam 0.1 M HEPES*¹ (separuh karnovsky)
• Penyelesaian pasca penetapan：1% larutan osmium tetroksida (OsO₄ dalam 0.1 J HEPES)
• Larutan basuh：0.1 M HEPES atau air suling
• Botol sampel

^*1 HEPES: singkatan larutan penampan 2- [4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinyl] asid etanesulfonic

3. Dehidrasi

Gunakan etanol atau aseton untuk menyahhidrat kandungan air dalam sel. Jika lembapan kekal, kandungan air yang tinggal akan menghalang pempolimeran resin semasa pembenaman resin berikutnya. Ikuti aliran di bawah untuk merendam spesimen dalam setiap kepekatan etanol untuk menggantikan kandungan air dengan etanol.

4. Penggantian

Apabila dehidrasi dengan etanol, ia digantikan dengan propilena oksida (PO) atau serupa sebagai agen perantaraan untuk dicampur dengan resin epoksi.

^*2 EPON 812：resin, ^*3 DDSA・^*4 MNA：pengeras, ^*5 DMP-30：agen pemecut

5. Penyematan

Untuk menyediakan bahagian ultra-nipis, adalah perlu untuk membenamkan spesimen dalam agen pembenaman keras seperti resin.
Resin cecair akan diawet semasa proses pempolimeran nanti.

Alatan

• Resin epoksi
• Plat benam silikon (Gamb. 1)

• Tuangkan damar
• Letakkan spesimen di hujung plat benam silikon
• Biarkan seketika untuk sebati

Rajah 1 Plat benam silikon

6. Pempolimeran

Panaskan resin untuk menyembuhkan, untuk membolehkan penghirisan nipis resin. Letakkan plat benam silikon di dalam ketuhar dan simpan pada suhu 60°C selama tiga hari. Menstabilkan suhu semasa pempolimeran boleh menghalang kegagalan pempolimeran resin.

Alatan

• Ketuhar untuk pempolimeran resin

7. Memangkas

Potong spesimen di bawah mikroskop optik supaya kawasan yang akan diperhatikan mempunyai saiz untuk diletakkan pada grid spesimen dan membentuk permukaan yang akan diperhatikan.

Alatan

• Pisau cukur
• Mikroskop optik

8. Pembahagian ultra-nipis

Keluarkan resin untuk mendedahkan permukaan tisu menggunakan pisau kaca. Kemudian potong menjadi kepingan nipis yang cukup untuk menghantar pancaran elektron dengan pisau berlian dan ultramikrotom, dan diletakkan di atas grid.

Alatan

• Ultramikrotome
• Grid
• Pisau berlian
• Pisau kaca

• Kuar bulu mata（Gamb. 2)

Rajah 2 Kuar bulu mata

9. Mewarna

Operasi ini digunakan untuk meningkatkan kontras spesimen biologi yang mengandungi banyak unsur cahaya. Kontras serakan dipertingkatkan dengan mengikat unsur berat pada spesimen. Apabila mengotorkan bahagian ultra-nipis pada grid, pewarnaan dua kali dilakukan menggunakan uranil asetat dan plumbum sitrat sebagai agen pewarnaan. Uranil asetat mengotorkan nukleoplasma dan ribosom, manakala sitrat plumbum mengotorkan membran sel, butiran glikogen dan ribosom.

Reagen

• Uranil asetat^*6
• Plumbum sitrat

^*6 Uranyl acetate adalah sebatian yang merupakan bahan terkawal antarabangsa yang hanya boleh digunakan di kemudahan berlesen.
Penyelesaian alternatif kepada uranil asetat termasuk ytterbium asetat.

Hasilnya

Rajah 3 menunjukkan hasil pemerhatian spesimen keratan ultra nipis yang disediakan dengan mengikut aliran di atas, dengan menggunakan TEM (JEM-1400Flash).

Rajah 3 imej TEM daun maple
Struktur membran organel boleh ditangkap dengan jelas.
Dalam imej kiri Rajah 3, radas Golgi boleh dilihat di tengah dan kloroplas pada kedua-dua belah.
Imej di sebelah kanan menunjukkan struktur membran mitokondria.