Pengukuran Protein Resolusi Tinggi Menggunakan Mod Lingkaran JMS-S3000 "SpiralTOF™" [Aplikasi MALDI]
MSTips No.297
Pengenalan
JMS-S3000 “SpiralTOF™” ialah spektrometer jisim masa penerbangan (TOFMS) yang menggunakan pengionan nyahsorpsi laser berbantukan matriks (MALDI).
MALDI ialah teknik pengionan lembut yang secara amnya mengekalkan ion utuh semasa pengionan. Walau bagaimanapun, pemecahan spontan selepas pengionan, dipanggil pereputan pasca sumber (PSD), juga diketahui berlaku semasa analisis MALDI.
Khususnya, apabila berat molekul analit meningkat, kesan JPA menjadi lebih ketara yang merumitkan spektrum jisim yang terhasil dan mengurangkan isyarat analit keseluruhan. SpiralTOF™ mempunyai laluan optik ion terlipat 17m yang secara automatik mengurangkan jumlah ion JPA yang mencapai pengesan, sekali gus meminimumkan kerumitan spektrum jisim. Selain itu, memilih matriks yang sesuai boleh mengurangkan JPA, yang seterusnya boleh meningkatkan isyarat protein utuh.
Dalam kajian ini, kami menggunakan JMS-S3000 untuk menguji beberapa matriks untuk kesan JPA dan untuk mengukur spektrum jisim resolusi tinggi insulin utuh, ubiquitin dan cytochrome C.
Eksperimen
Tiga protein – Insulin (10pmol/μl 1%TFA), ubiquitin (100pmol/μl air) dan sitokrom C (10pmol/μl air) – digunakan untuk eksperimen ini.
ClCCA(4-chloro-α-cyanocinnamic acid) [1] telah dilarutkan dalam 70% asetonitril/0.1%TFA (10mg/ml). Selain itu, insulin juga diukur menggunakan CHCA (asid α-cyano-4-hydroxycinnamic) dan SA (asid sinapinik), yang biasanya digunakan matriks untuk pengukuran protein.
Larutan campuran sampel dan setiap matriks dikesan pada plat sasaran dan dikeringkan di udara. Spektrum jisim diperoleh dengan menggunakan mod ion positif SpiralTOF dan LinearTOF.
Hasil
Sebagai titik permulaan, mod LinearTOF digunakan untuk mengukur insulin dengan setiap matriks (CHCA, SA, dan ClCCA) seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1.
Dalam setiap kes, [M+H]+ puncak menunjukkan nisbah S/N yang baik untuk semua matriks apabila menggunakan keadaan pengukuran yang setara. Keputusan LinearTOF ini menunjukkan keadaan ion sejurus selepas rantau pecutan, di mana kesan JPA biasanya tidak ketara.
Hanya puncak spektrum jisim CHCA menunjukkan bentuk puncak yang lebih luas yang menunjukkan kesan JPA yang agak besar. Seterusnya, bintik-bintik ini diukur semula dalam mod SpiralTOF, dan spektrum jisim yang terhasil ditunjukkan dalam Rajah 2.
Spektrum jisim untuk semua matriks menunjukkan [M+H]+ puncak dengan pemisahan puncak isotop yang baik. Walau bagaimanapun, spektrum jisim CHCA menunjukkan nisbah S/N yang lebih rendah daripada spektrum jisim SA dan ClCCA, sekali gus menyokong pemerhatian mod LinearTOF bahawa terdapat kesan JPA yang lebih tinggi untuk matriks tertentu ini. Spektrum jisim SA dan ClCCA kedua-duanya menunjukkan puncak insulin dengan nisbah S/N yang baik untuk keadaan pengukuran yang sama. Khususnya, puncak insulin ClCCA menunjukkan nisbah S/N yang lebih tinggi daripada 2 matriks lain, menunjukkan bahawa matriks ini lebih baik untuk meminimumkan kesan JPA.
Rajah 1. Spektrum jisim insulin yang diperoleh dengan menggunakan mod LinearTOF dengan (A) CHCA, (B) SA dan (C) keadaan matriks ClCCA.
Rajah 2 Spektrum jisim insulin yang diperoleh dengan menggunakan mod SpiralTOF dengan (A) CHCA, (B) SA dan (C) keadaan matriks ClCCA.
Seterusnya, spektrum jisim ubiquitin dan cytochrome C diperoleh dalam mod SpiralTOF menggunakan ClCCA (Rajah 3).
[M+H]+ ion telah diperhatikan untuk kedua-dua protein dengan nisbah S/N yang baik. Di samping itu, puncak isotop ubiquitin dan cytochrome C telah diselesaikan dengan baik, dan kuasa penyelesaian jisim untuk setiap sebatian adalah kira-kira 48000 dan 36000, masing-masing.
Rajah 3 Spektrum jisim ubiquitin (A) dan sitokrom C (B) dengan mod SpiralTOF menggunakan ClCCA
Ringkasan
SpiralTOF™ berkesan untuk pengukuran resolusi tinggi bagi protein utuh. Memilih sebatian matriks yang sesuai seperti ClCCA boleh membantu mengurangkan kesan JPA yang seterusnya meningkatkan pengukuran protein dengan berat molekul melebihi 5000Da.
Rujukan
[1] Jaskolla TW, Lehmann WD, Karas M. 4-Chloro-α-cyanocinnamic acid ialah matriks MALDI yang direka bentuk secara rasional. Proc Natl Acad Sci USA 2008;105:12200–12205.
- Sila lihat fail PDF untuk mendapatkan maklumat tambahan.
Tetingkap lain terbuka apabila anda mengklik. 
PDF 594KB
Produk Berkaitan
Adakah anda seorang profesional perubatan atau kakitangan yang terlibat dalam penjagaan perubatan?
Tidak
Sila diingatkan bahawa halaman ini tidak bertujuan untuk memberikan maklumat tentang produk kepada orang ramai.