Mikroskopi Elektron Biologi; Mencari Data Penting Evermore untuk Penemuan Baharu dalam Penyelidikan Biologi

TEMUDUGA 08

Roland Fleck
Profesor di King's College London, United Kingdom

Memahami struktur selular dan molekul adalah asas utama penyelidikan bioperubatan. Profesor Roland Fleck, yang merupakan Pengarah CUI (Pusat Pengimejan Ultrastruktur) di King's College London, mendedikasikan dirinya untuk pengimejan resolusi tinggi struktur mereka menggunakan mikroskop elektron JEOL. Dia menggunakan kedua-dua mikroskop elektron pengimbasan dan penghantaran, cth, JSM-7800FPRIME, JEM-F200 serta instrumen JEOL lain dengan kerjasama JEOL. Pusat itu, yang merupakan Pusat Teknologi Lanjutan JEOL (JCAT) mengkhusus dalam kedua-dua suhu bilik dan teknik mikroskop elektron cryo.

Mengapa penting untuk memahami proses biologi yang kompleks.

CUI (Pusat Pengimejan Ultrastruktur) di King's College London, di bawah pengarahan Profesor Fleck menumpukan pada aplikasi teknik pengimejan termaju menggunakan kedua-dua mikroskop elektron penghantaran (TEM) dan mikroskop elektron pengimbasan (SEM) untuk memahami proses biologi yang kompleks. "Proses biologi" merangkumi pelbagai jenis fenomena biologi, termasuk organisasi genomik, transduksi isyarat, perkembangan kitaran sel dan sistem kompleks lain.

Tubuh manusia mempunyai kawasan yang berbeza khusus untuk fungsi yang berbeza: mata melihat, kaki berjalan. Pengkhususan fungsi spatial berlaku pada setiap skala: dalam mata, kanta dan sel fotoreseptor menyumbang secara berbeza kepada penglihatan, dan molekul yang berbeza berkumpul ke bahagian yang berlainan bagi setiap sel fotoreseptor melakukan tugas yang berbeza (sesetengah mengesan cahaya, yang lain memberitahu otak bahawa cahaya dikesan ). Walau bagaimanapun, tahap pembesaran molekul adalah sekitar 1,000,000x. Ini tidak boleh dicapai dengan mikroskop cahaya biasa, dan memerlukan mikroskop menggunakan panjang gelombang elektron yang lebih pendek. Walau bagaimanapun, mikroskop elektron biasanya terhad untuk melihat sampel tisu yang sangat nipis, 1/1000 ketebalan rambut manusia, dan memerlukan beratus-ratus bahagian nipis ini untuk mengandungi semua satu sel.

Sel dan tisu juga mesti disediakan terlebih dahulu untuk kajian dalam mikroskop elektron. Cara penyediaan ini dilakukan memerlukan kepakaran dalam pelbagai bidang dan penyelidikan untuk memahami dan mengoptimumkan prosedur penyediaan spesimen. Profesor Fleck berusaha untuk menambah baik penyediaan sampel melalui penyelidikan, untuk mendapatkan maklumat berkualiti tinggi daripada sampel. "Dalam konteks inilah kerjasama dengan JEOL sangat berharga," kata Profesor Fleck.

Cryopreperation tisu biologi.

Tisu biologi terdiri daripada kumpulan sel. Sebagai contoh, jantung ialah organ yang terdiri daripada pelbagai tisu (miokardium, saluran darah, saraf, dll.) dan memainkan peranan biologi dengan tisu ini terikat di bawah susunan tertentu. Jadi, memahami morfologi dan struktur tisu adalah penting.

Mikroskopi cryo-elektron membolehkan pemerhatian sampel tisu sedemikian dengan menggunakan suhu rendah untuk mengekalkan keadaan "asli"nya. Sampel disejukkan dan disimpan pada suhu yang sangat rendah dalam peringkat "cryo" yang dipasang pada mikroskop elektron. Pengelakan ais kristal semasa pembekuan (vitrifikasi) adalah asas untuk membuka kunci potensi penyelesaian mikroskop cryo-elektron. Vitrifikasi membolehkan struktur dilihat dalam keadaan asalnya, mengelakkan artifak yang biasanya dikaitkan dengan teknik penyediaan penetapan kimia dan dehidrasi serta gangguan ultrastruktur yang dikaitkan dengan pembentukan ais intraselular.

Profesor Fleck menggunakan banyak teknik cryo yang masing-masing menangani cabaran mengelakkan hablur ais semasa membeku. Penyejukan pantas membolehkan vitrifikasi isipadu kecil melalui penggunaan cryogen perantaraan (cth, etana atau propana). Ini mengelakkan kesan Leidenfrost (di mana filem wap penebat, dicipta dengan menaikkan kriogen di atas takat didihnya, memperlahankan penyejukan). Inilah pendekatan yang diwujudkan oleh Jacques Dubochet (Kimia Hadiah Nobel pada 2017) untuk menvitrifkan zarah terpencil kecil sebagai filem pada grid TEM untuk TEM zarah tunggal. Untuk sampel keseluruhan sel atau tisu yang lebih tebal, penyejuk beku tekanan tinggi digunakan. Teknik pembekuan tekanan tinggi (HPF) adalah berdasarkan fizik air: tekanan 2100 bar yang digunakan semasa pembekuan bertindak sebagai cryoprotectant fizikal; tekanan tinggi menghalang pengembangan air apabila penghabluran, dengan itu melambatkan pembentukan hablur ais dan mengurangkan kadar penyejukan kritikal yang diperlukan untuk vitrifikasi (10,000°Cs-1).

Blok tisu yang divitrifikasi boleh diproses dengan penggantian beku, dipotong pada suhu kriogenik (CEMOVIS) atau patah dan diperhatikan secara langsung dalam cryo SEM atau mengikuti penjanaan replika yang dilihat dalam TEM. Profesor Fleck menggunakan setiap teknik ini untuk menangani soalan yang berbeza. Contohnya HPF kini disepadukan dengan rangsangan elektrik dan rangsangan cahaya yang membolehkan tahap korelasi temporal yang tinggi antara rangsangan dan imobilisasi apabila digunakan untuk mengkaji bagaimana maklumat dipindahkan dari satu neuron ke neuron yang lain di dalam otak.

Dalam mikroskop cahaya, tag pendarfluor digunakan untuk memaparkan protein yang terhad kepada petak dalam sel hidup, tetapi tidak memberi gambaran tentang ultrastruktur yang mendasarinya. Mikroskop elektron mempunyai resolusi untuk memaparkan ultrastruktur selular tetapi tidak dapat "melihat" tag pendarfluor. Sebaliknya pelabelan immunogold digunakan untuk menggambarkan (menanda) lokasi (penyetempatan) sel sasaran (khusus) dan/atau tisu dengan mikroskop elektron, dengan menggunakan tindak balas antigen-antibodi di mana antibodi mengikat secara khusus kepada sel dan/atau tisu antigen. Untuk teknik ini, kaedah pembahagian ultranipis beku (teknik Tokuyasu) mula-mula memperkenalkan cryoprotectant (sukrosa) untuk menyekat pembentukan hablur ais semasa kadar penyejukan yang agak perlahan yang dicapai dengan menjunamkan sampel terus ke dalam nitrogen cecair (~ <100°Cs).-1). Tisu itu kemudiannya dibelah oleh cryo ultramicrotomy dan dilabelkan dengan immunogold.

Rajah 1. Pelabelan dwi titisan lipid dalam sel yang dijangkiti virus Hepatitis C. Dua saiz emas koloid yang berbeza digunakan untuk melabelkan protein yang berbeza yang diminati dan menunjukkan bahawa mereka masing-masing disetempat pada membran dalaman titisan lipid. Tisu telah disediakan, dipotong dan dilabel menggunakan teknik Tokuyasu. Pelabelan dwi diserlahkan dalam bulatan biru.

Kepentingan Memahami Struktur Sel dan Molekul oleh SEM dan TEM kepada Parasitologi.

Memahami struktur selular dan molekul Malaria adalah penting untuk membangunkan rawatan anti-malaria yang berkesan. Malaria, Plasmodium falciparum, parasit berkembang dalam sel darah merah (eritrosit) dan terkandung di dalam vakuol parasitophorus yang tertutup membran. Semasa perkembangannya, parasit mengubahsuai permukaan sel darah merah yang membawa kepada ketegaran sitoskeleton dalam sel yang dijangkiti, dan untuk penghantaran kepada sitoskeleton daya ricih yang dialami oleh sel yang melekat. Setelah dibangunkan sepenuhnya, proses berbilang peringkat yang disebut egress berlaku. Untuk melakukan ini, parasit mengatur urutan kebolehtelapan membran yang sangat terkawal dan langkah-langkah pecah yang memuncak dalam pelepasan parasit yang meletup untuk pusingan baru jangkitan.

Memahami proses ini adalah kunci untuk membuka kunci kitaran hidup malaria. Untuk kajian ini, tomografi elektron berguna. Tomografi elektron ialah kaedah untuk membina semula struktur dalaman tiga dimensi sampel melalui pemprosesan imej komputer bagi banyak imej unjuran, yang diperoleh daripada imej siri kecondongan berurutan sampel. Profesor Fleck menggunakan tomografi elektron tekanan tinggi beku, sel darah merah yang dijangkiti beku dan tomografi elektron cryo bagi hantu sel darah merah yang divitrifikasi untuk memeriksa pengubahsuaian 3 dimensi permukaan sel darah merah. Rangka tombol yang sangat teratur yang terdiri daripada struktur lingkaran yang disalut oleh lapisan padat elektron berada di bawah membran tombol. Rangka tombol ini disambungkan dengan berbilang pautan kepada sitoskeleton eritrosit. Susunan protein membran dalam tombol kemudian divisualisasikan oleh SEM patah beku resolusi tinggi. Sampel disediakan dengan pembekuan tekanan tinggi dan patah beku parasit hidup. Struktur membran didedahkan pada resolusi tinggi dan struktur tombol adalah berbeza daripada yang ada di membran eritrosit di sekelilingnya, dengan struktur di puncak yang mungkin mewakili tapak lekatan. Oleh itu, telah ditunjukkan bahawa tombol eritrosit dalam jangkitan P. falciparum mengandungi struktur rangka yang sangat teratur yang mendasari kawasan khusus membran.

Rajah 2. Malaria, Plasmodium falciparum, parasit berkembang dalam sel darah merah (eritrosit). Tujuh merozoit terkandung dalam vakuol parasitophorus yang tertutup membran. Merozoit terletak di sekeliling badan sisa pusat. Disebabkan oleh proses patah banyak membran individu didedahkan.

Pembinaan Semula 3D menggunakan SEM Muka Blok Bersiri

Mempelajari otak adalah penting kerana mendedahkan hubungan sel saraf dalam otak membawa kepada pemahaman tentang mekanisme pembelajaran dan ingatan. Analisis connectome yang bertujuan untuk mendedahkan semua hubungan antara semua sel saraf dalam otak adalah objektifnya. Untuk menggambarkan sambungan ini TEM membenarkan pemerhatian sambungan antara neuron, tetapi kawasan yang boleh diperhatikan adalah sangat nipis dan terhad. "Jadi dalam kes ini, SEM Muka Blok Bersiri (SBF-SEM) sangat berkesan," kata Profesor Fleck.

SEM Muka Blok Bersiri (SBF-SEM) ialah kaedah untuk membina semula struktur tiga dimensi (3D) bagi blok spesimen menggunakan SEM. Kaedah ini digunakan terutamanya untuk pembinaan semula 3D bahan lembut seperti tisu "otak" neuron tertanam resin. Spesimen blok tisu otak dihiris dengan ketebalan ~ 30 nm kepada isipadu > 500 μm dari permukaan dengan ultramikrotom yang dimasukkan ke dalam ruang spesimen SEM, dan kemudian setiap muka yang terdedah dengan menghiris diperhatikan. Imej yang dikumpul disusun untuk mendapatkan struktur 3D blok spesimen.

Mengecas sampel semasa SBF-SEM boleh mengehadkan kualiti data yang dijana untuk meningkatkan kekonduksian blok tisu, jadi teknik OTO digunakan (osmium tetroxide–thiocarbohydrazide–osmium tetroxide). Protokol ini meningkatkan kontras lipid, SBF-SEM pra-tarikh lama. Profesor Fleck menggunakan SBF-SEM dan menyesuaikan serta mengubah suai teknik pemprosesan lama ini untuk menghasilkan pewarnaan sekata di seluruh blok tisu, tanpa bahaya mendakan besar untuk memberikan isyarat serakan belakang yang kuat dan kekonduksian tinggi dalam SBF-SEM. Menggunakan teknik ini, Profesor Fleck memetakan taburan struktur terminal presinaptik dalam CA1 stratum orients, kawasan hippocampus yang menerima input axonal tertib. Susunan data daripada berbilang wilayah telah dibina semula dan, dengan menggunakan penanda rujukan dalam tisu, data berkorelasi dengan input sinaptik yang ditentukan oleh kolaborator. Walaupun segmen dendritik menunjukkan taburan yang luas dalam saiz input pengujaan, terdapat korelasi yang kuat antara ukuran morfologi petak presinaptik dan postsynaptic. Boton presinaptik yang terbentuk pada dendrit basal neuron piramid CA1 memaparkan pengurangan saiz zon aktif (AZ) dengan jarak dari soma. Ini memberikan peningkatan yang bergantung kepada jarak dalam kemudahan (fungsi) jangka pendek. Oleh itu, taburan spatial kemudahan jangka pendek yang dimodulasi oleh morfologi berfungsi untuk mengimbangi pengecilan elektrotonik input distal subambang semasa rangsangan berulang dan memperhalusi frekuensi input pilihan domain dendritik.

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) untuk menggabungkan mikroskop optik dan mikroskop elektron

Kaedah ini (CLEM) menggunakan gabungan unik ciri mikroskop optik dan mikroskop elektron. Ia digunakan untuk mengenal pasti protein atau tisu terlebih dahulu menggunakan mikroskop pendarfluor di mana protein atau tisu tertakluk kepada pewarnaan pendarfluor (pelabelan), dan kemudian untuk memerhati morfologi atau struktur kawasan sasaran yang dikenal pasti menggunakan mikroskop elektron dengan resolusi spatial yang tinggi. CLEM digunakan secara meluas dalam bio-sains, di mana analisis fungsi dan morfologi (struktur) halus protein atau tisu berlabel boleh dibuat. CLEM boleh digabungkan dengan sama ada mikroskop elektron TEM atau SEM dan dengan penambahan peringkat kriogenik pakar boleh menyokong korelasi antara pendarfluor dan instrumen EM cryo resolusi tinggi. Dalam CUI terdapat berbilang aliran kerja CLEM untuk diikuti. Ini termasuk aliran kerja suhu bilik Nikon hingga JEOL SEM di mana sel-sel ditanam pada hidangan kultur tisu khas yang menyokong pengimejan sel hidup. Hidangan kultur tisu ini membolehkan korelasi antara proses sel dan pengimejan dalam SEM selepas pemprosesan sampel suhu bilik.

Pusat JEOL untuk Teknologi Termaju untuk Kemajuan Lanjut Sains Hayat

Menggabungkan mikroskop elektron cryo dan pendekatan biologi struktur untuk menentukan struktur selular 3D "in situ" daripada bahagian sel dan tisu yang divitrifikasikan ialah sempadan yang baru muncul untuk biologi sel. Ia memerlukan bukan sahaja TEM cryo tetapi juga penetapan cryo dan alat pembahagian cryo. Ini termasuk mengoptimumkan pancaran ion fokus terkini SEM (FIB-SEM) daripada JEOL JIB-4700F untuk memanfaatkan penyediaan lamella vitreous FIB dan pemindahan bebas pencemaran ke cryo TEM.

Profesor Fleck berkata, "Mikoskopi Elektron Biologi telah mencapai kemajuan yang luar biasa dalam dekad yang lalu ini. Kami kini akan berusaha untuk meneroka cabaran baharu melalui kerjasama rapat dengan JEOL. Kami mempunyai banyak, banyak idea untuk bertukar dan cadangan untuk pembangunan instrumen termaju. Saya teruja untuk menjadi sebahagian daripada inovasi masa depan ini.”

Pusat Teknologi Lanjutan JEOL (JCAT) juga memainkan peranan penting yang menyumbang kepada masyarakat. JCAT menyediakan pelbagai teknologi kepada hospital tempatan untuk diagnosis penyakit buah pinggang, penyakit kulit, dsb. kamera JEOL RUBY yang dilengkapi pada JEOL JEM-1400Plus sangat berkesan untuk menjalankan biopsi dengan operasi yang mudah.
Profesor Flecks menekankan "JCAT, yang ditubuhkan berdasarkan perkongsian dengan JEOL, akan menjadi platform penting di mana idea-idea baharu instrumen dan teknik akan dilahirkan disebabkan hubungan kerjasama kami yang membina, yang membawa kepada kemajuan lanjut dalam kajian sains hayat."

Disiarkan: Mac 2019

Mikroskop Elektron Penghantaran (TEM)