Mikroskopi cryo-elektron mendedahkan misteri kehidupan dengan menyiasat pelbagai struktur molekul dalam "pembekuan dalam".
TEMUDUGA 07
Keiichi Namba
Profesor di Sekolah Siswazah Biosains Frontier, Universiti Osaka.
Protein membentuk semua organisma hidup dan bertanggungjawab untuk pelbagai fungsi, seperti imuniti, metabolisme, fungsi serebrum dan motilitas. Profesor Keiichi Namba, yang mengetuai Kumpulan Protonic NanoMachine dari Sekolah Siswazah Biosains Frontier di Universiti Osaka berminat dengan mekanisme luar biasa yang mendasari fungsi ini dan secara aktif berusaha untuk mendedahkan rahsia mereka dengan mengkaji struktur tiga dimensi (3D) molekul biologi. .
Memahami Fungsi daripada Struktur
Tubuh manusia terdiri daripada kira-kira 100,000 jenis protein yang berbeza. Setiap daripada mereka mempunyai peranan yang unik seperti membentuk tisu badan, memangkinkan metabolisme, menukar nutrien merentasi membran sel, atau memusnahkan bahan asing. Fungsi-fungsi ini membentuk beberapa aktiviti penting badan kita.
"Protein ialah sejenis mesin nano yang berfungsi dalam badan hidup. Saya sangat berminat dengan peranan yang dimainkan oleh mesin nano tersebut dan bagaimana ia bertindak," kata Profesor Namba. Selama lebih 40 tahun, prof. Namba telah terlibat dalam penyelidikan untuk mendedahkan fungsi protein daripada strukturnya.
Protein ialah polimer linear yang mengandungi ratusan atau ribuan asid amino. Terdapat hanya 20 asid amino berbeza yang membentuk protein, kecuali beberapa asid amino khas. Oleh itu, kombinasi berbeza asid amino ini dalam urutan yang berbeza membentuk 100,000 jenis protein yang berbeza. Frasa "polimer linear" mungkin menimbulkan imej rantai fleksibel. Walau bagaimanapun, strukturnya berbeza sama sekali daripada rantai kerana setiap protein mempunyai struktur 3D yang berbeza. Malah, rantai panjang asid amino dilipat menjadi struktur yang kompleks, dan struktur ini adalah sama antara protein jenis yang sama; struktur lipatan pada titik yang sama dan pada sudut yang sama. Walau bagaimanapun, lipatan sedemikian kadangkala boleh berbeza-beza, dan menariknya, struktur molekul yang sama, tetapi dengan struktur 3D yang berbeza, boleh mempamerkan sifat yang sama sekali berbeza dan menggunakan fungsi yang berbeza. Sebagai contoh, punca masalah BSE yang menyebabkan panik dalam industri makanan pada awal 2000-an dikatakan sebagai protein yang dipanggil prion, bukan virus mahupun agen kimia. Yang menghairankan, prion adalah asli kepada otak manusia dan lembu. Prion ini berbeza daripada prion tidak normal yang menyebabkan BSE hanya pada beberapa bahagian struktur 3D mereka. Oleh itu, untuk mengenal pasti fungsi protein, adalah perlu bukan sahaja untuk memahami struktur molekulnya dengan menggunakan peralatan dan kaedah analisis tetapi juga untuk memerhati struktur 3D mereka secara terperinci.
Motor Molekul Biologi yang Canggih
Prof. Namba adalah salah seorang perintis dalam penyelidikan mengenai struktur 3D molekul biologi. Beliau amat berminat dengan sekumpulan protein yang dipanggil motor molekul. Ia dipanggil motor kerana ia mempamerkan gerakan berputar atau linear serupa dengan motor buatan manusia. Sebagai contoh, otot manusia terbentuk daripada myofibrilla, yang kebanyakannya terdiri daripada protein aktin dan miosin yang dipasang dalam bentuk filamen, dan gerakan linear filamen protein ini menyebabkan penguncupan otot. Menyerupai motor putar buatan manusia dengan lebih dekat ialah motor flagellar bakteria, yang memutarkan filamen heliks panjang seperti ekor yang dipanggil flagellum sebagai kipas untuk memacu motilitas sel bakteria dalam persekitaran likat. Escherichia coli dan Salmonella mempunyai beberapa flagela, iaitu digabungkan untuk menghasilkan tujahan, sama seperti skru. Walau bagaimanapun, struktur motor molekul sukar untuk dilihat untuk masa yang lama.
Prof. Namba menjadi taksub dengan misteri dan memulakan satu siri kajian penyelidikan untuk mendedahkan struktur 3D motor molekul ini. Motor flagellar terdiri daripada kira-kira 30 protein berbeza yang membentuk substruktur, seperti rotor, stator dan sesendal, dan strukturnya hampir menyerupai motor elektrik generik. Gentian otot diperbuat daripada berkas interdigitated aktin dan filamen miosin membentuk kekisi heksagon yang sangat berharga. Motor industri dikatakan sebagai salah satu ciptaan manusia yang paling hebat, tetapi penemuan di atas menunjukkan bahawa tanggapan ini mungkin merupakan anggapan yang angkuh.
Pergerakan terkoordinasi motor molekul ini memerlukan tenaga. Walaupun diketahui bahawa ion hidrogen mengalir melalui saluran pemegun motor flagellar oleh kecerunan potensi elektrokimia merentasi membran sel dan bahawa hidrolisis ATP oleh actomyosin ialah sumber tenaga untuk penguncupan otot, kecekapan tenaga tinggi mereka adalah misteri. Telah dihujahkan bahawa tenaga gerakan Brown terma mungkin terlibat, tetapi mekanisme bagaimana ia digunakan tidak diketahui. Sumber haba membekalkan tenaga untuk turun naik atom dan molekul, tetapi apabila objek dianggap pada tahap atom, atom dan molekul bergerak ke arah sewenang-wenangnya pada kelajuan sewenang-wenangnya.
Dianggap bahawa walaupun motor molekul tidak dapat menghasilkan tujahan dalam arah tertentu melalui gerakan rawak yang disebabkan oleh haba molekul dan atom. Namun, mereka sebenarnya bergerak ke satu arah. Oleh itu, wujud mekanisme yang membetulkan gerakan rawak.
Baru-baru ini, Prof. Namba semakin hampir dengan jawapannya. Dia mendapati bahawa actomyosin dalam gentian otot berstruktur seperti ratchet yang membolehkan gerakan pilihan dalam satu arah, tetapi tidak di arah yang lain. Sistem canggih sedemikian dibina daripada molekul protein dengan struktur 3D yang tidak simetri dan dinamik.
Cryomicroscopy sebagai Frontier
Mikroskop cryo-elektron JEOL "CRYO ARM™" di makmal Profesor Namba
Penemuan yang disebutkan di atas dimungkinkan dengan pengimejan terperinci struktur 3D protein dan kompleksnya. Analisis struktur oleh kristalografi sinar-X telah menjadi kaedah arus perdana untuk menentukan struktur protein. Dalam kaedah ini, sampel protein terhablur disinari dengan pancaran sinar-X, dan keamatan rasuk difraksi diukur. Penghabluran protein sinar-X telah wujud sejak tahun 1950-an, dan 90% daripada struktur protein yang diketahui telah diselesaikan dengan menggunakan kaedah ini.
Walau bagaimanapun, kaedah ini mempunyai kelemahan utama: penghabluran adalah prasyarat untuk analisis tetapi tidak mudah. Di samping itu, penghabluran cenderung untuk menetapkan struktur protein dalam struktur yang paling stabil. Walaupun motor molekul mengubah strukturnya dengan ketara semasa menjalankan fungsinya, ia boleh dihablurkan hanya dalam keadaan stabilnya. Dalam erti kata lain, struktur 3D yang berbeza-beza tidak boleh diperhatikan.
Mikroskopi cryo-elektron mendapat perhatian sebagai cara untuk mengatasi kelemahan ini. Mikroskop cryo-elektron dilengkapi dengan peringkat sampel yang dipanggil "peringkat cryo," yang membolehkan suhu grid sampel disimpan pada suhu ultrarendah, contohnya antara -160°C dan -270°C. Molekul protein dalam filem nipis larutan pada grid karbon berlubang dibekukan serta-merta menggunakan etana cecair untuk mengekalkan konformasi keadaan "hidup". Merakam imej unjuran dari pelbagai arah yang berbeza menggunakan mikroskop cryo-elektron membolehkan struktur 3D protein ini ditangkap pada saat yang tepat berfungsi. Selain itu, hanya sejumlah kecil larutan sampel perlu dibekukan, dan tidak perlu meneroka beberapa keadaan penghabluran.
Prof. Namba memberi tumpuan kepada mikroskop cryoelectron dan mempromosikan pembangunan kaedah analisis dengan mikroskop cryo-elektron selama lebih 20 tahun. Pengenalpastian mekanisme fungsi actomyosin dalam gentian otot adalah satu pencapaian yang dimungkinkan oleh mikroskop cryoelectron. Mendedahkan perincian struktur 3D motor flagellar, yang merupakan impian Prof. Namba yang telah lama diingini, bukanlah mimpi lagi.
"Mengapa tindakan bahan-bahan kecil seperti protein membawa kepada pergerakan otot yang kelihatan? Inilah persoalan yang membawa saya ke bidang penyelidikan ini pada zaman persekolahan saya. Sekarang saya rasa saya telah dapat menjawab kira-kira separuh daripada soalan yang saya mempunyai hari-hari itu," kata Prof. Namba.
Mikroskop yang Terbaik di Dunia
Prof. Kato (kiri) dan Prof. Namba mengendalikan CRYO ARM™ dari bilik yang berasingan
Mikroskopi cryo-elektron telah lama ketinggalan di belakang analisis struktur sinar-X kerana resolusi bekas yang tidak mencukupi. Mikroskop elektron menyinari sampel dengan pancaran elektron yang sengit, elektron bertaburan dalam sampel, dan kanta mencipta imej sampel mengikut penyerakan elektron. Walau bagaimanapun, kerana molekul biologi mudah rosak oleh rasuk elektron, keamatan rasuk perlu dilemahkan dengan tinggi menggunakan teknik dos rendah untuk mengelakkan kerosakan sinaran. Kita hanya boleh melihat imej yang kabur dan bising seperti apabila hanya ada mentol kecil di dalam bilik gelap.
Walau bagaimanapun, usaha lama dalam pembangunan teknologi kini telah membantu kami mengatasi isu ini. Dari segi perkakasan, kamera telah mengalami peningkatan yang ketara. Kamera CCD konvensional menukarkan elektron bertaburan kepada cahaya sebelum mencipta imej, dan pelbagai jenis hingar dijana dan dikuatkan dalam proses ini. Oleh itu, prestasi pengesanan tidak dapat dipertingkatkan. Walau bagaimanapun, kemunculan kamera CMOS yang mampu mengesan elektron secara langsung untuk merakam imej, telah meningkatkan kedua-dua kepekaan dan resolusi malah membenarkan pembetulan pergerakan spesimen dengan pengimejan kadar bingkai tinggi. Oleh itu, kualiti imej yang dipertingkatkan secara drastik boleh diperoleh menggunakan kamera ini.
Perisian pemprosesan imej juga telah mengalami kemajuan yang luar biasa. Dengan perisian masa kini, ratusan ribu imej unjuran molekul protein dalam semua orientasi berbeza boleh diperolehi dengan mudah dengan cryo-mikroskop. Unjuran ini dikelaskan kepada kumpulan di mana setiap kumpulan mengandungi unjuran dalam orientasi yang sama. Imej kelas yang sama kini boleh ditindih untuk meningkatkan nisbah isyarat kepada hingar, sekali gus membolehkan pemerhatian perincian resolusi tinggi. Dalam langkah terakhir, banyak purata kelas digabungkan menjadi struktur 3D. Pemprosesan data yang kompleks sedemikian dimungkinkan di peringkat makmal kerana kapasiti pemprosesan lanjutan komputer moden.
CRYO ARM™ yang diperkenalkan di makmal Prof. Namba direka untuk memenuhi keperluannya untuk "mikroskop terbaik dunia." Sasaran reka bentuk adalah untuk membolehkan analisis struktur pada resolusi lebih baik daripada 2.0 Å (1 Å atau angstrom bersamaan dengan 0.1 nm), yang lebih baik daripada kristalografi sinar-X standard. Selanjutnya, berbilang grid sampel boleh dimuatkan ke dalam CRYOARM™ dan ditukar secara automatik ke peringkat spesimen pada bila-bila masa untuk kemudahan pengguna. Pengurangan besar dalam masa yang diperlukan untuk pengumpulan dan analisis data imej adalah salah satu kelebihan terbesar mikroskop ini. Analisis struktur 3D yang dahulunya mengambil masa satu tahun kira-kira 5 atau 6 tahun yang lalu kini boleh disiapkan dalam masa seminggu.
Terobosan Hanya Sekitar Sudut
Prof. Namba percaya bahawa struktur 3D bukan sahaja protein tetapi juga mana-mana kompleks biomolekul lain, termasuk lipid dan asid nukleik, akan divisualisasikan dalam masa 5 tahun.
Aplikasi yang sangat penting ialah analisis protein membran pada permukaan sel. Protein ini adalah sasaran tindakan reagen farmaseutikal, dan analisis struktur 3D mereka akan membantu mendedahkan mekanisme yang mendasari fungsi molekulnya, meningkatkan hasil terapi secara dramatik, dan memungkinkan pembangunan ubat tanpa kesan sampingan.
Pada masa hadapan, mungkin terdapat pergerakan ke arah aplikasi perindustrian motor molekul biologi, seperti mesin penjimatan tenaga super yang memerlukan sumber kuasa minimum dan beroperasi menggunakan haba ambien sebagai sumber tenaga utama. Tanggapan paradoks ini boleh menentang kepercayaan lama tentang jentera dan kejuruteraan.
Walaupun kita masih jauh untuk merealisasikan ciptaan seperti itu, kesedaran mereka mungkin terbukti tidak lama lagi.
β-galactosidase 2.6 Å resolusi CRYO ARM™
Contoh:
β-galactosidase dengan PETGMikroskop:
CRYO ARM™ (Schottky 200 kV) / puncak K2Bilangan Imej:
2,500 dalam tempoh 3 hari oleh JADASSaiz piksel imej:
0.8 Å/pikselBilangan imej zarah:
350,000(Pilihan awal), 88,564 (untuk pembinaan semula 3D terakhir)perisian:
Motioncor2, Gctf, Gautomatch, Relion2.0Jumlah dos:
70 e-/Å2 (70 bingkai (0.2 saat/bingkai x 14 saat)
Data: ihsan oleh Dr. T. Kato dan Dr. K. Namba, Universiti Osaka, Ogos 2017
Keiichi Namba
Profesor di Sekolah Siswazah Biosains Frontier, Universiti Osaka.
Selepas menamatkan kursus kedoktoran di Sekolah Siswazah Sains Kejuruteraan, Universiti Osaka, beliau telah dilantik sebagai Felo Penyelidik Persatuan Promosi Sains Jepun, Associate Penyelidik di dua universiti di AS, dan Ketua Kumpulan Perbadanan Pembangunan Penyelidikan. Jepun (Agensi Sains dan Teknologi Jepun sekarang). Beliau kemudiannya menyandang jawatan Pengarah Penyelidikan di Institut Antarabangsa bagi Penyelidikan Lanjutan Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. pada tahun 1992. Beliau telah memegang jawatan sekarang sejak 2002. Beliau mempunyai kepakaran dalam bidang biofizik serta analisis struktur dan fungsi kompleks biomolekul, seperti motor molekul.
Disiarkan: Oktober 2017