Analisis Metabolit Bukan Sasaran dalam Sake dengan menggunakan Kromatograf Gas - Spektrometer Jisim Masa-Penerbangan (GC-TOFMS)

Pengenalan

Sake ialah minuman beralkohol Jepun yang dibuat terutamanya daripada beras, kome-koji, dan air. Selain alkohol, sake mengandungi asid amino, asid organik, dan gula, yang menghasilkan pelbagai rasa dan rasa. Sake juga diklasifikasikan sebagai 'Daiginjo-shu', 'Junmai-shu', dan 'Honjozo-shu', bergantung pada nisbah penggilap beras dan sama ada alkohol suling ditambah atau tidak dan jenis sake lain diklasifikasikan sebagai 'futsu-shu '¹⁾. Asid amino, asid organik, dan gula dalam sake dianggap berasal daripada metabolisme mikroorganisma seperti kome-koji dan yis. Oleh itu, mungkin untuk mengklasifikasikan jenis sake ini dengan analisis metabolomik.
Spektrometer jisim kromatografi gas (GC-MS) digunakan secara meluas untuk metabolomik kerana pangkalan datanya yang kaya, operasi yang mudah dan kebolehulangan pengukuran yang tinggi. Sasaran pengukuran GC-MS ialah sebatian meruap. Walau bagaimanapun, proses derivatisasi seperti trimethylsilylation boleh digunakan untuk mengukur metabolit sangat polar seperti gula dan asid amino. Selain itu, dalam bidang metabolomik, "sebatian tidak diketahui" yang tidak didaftarkan dalam pangkalan data perpustakaan (DB) kadangkala dikesan. Dalam kes ini, formula molekul bagi sebatian yang tidak diketahui pun boleh ditentukan dengan menggunakan spektrometer jisim masa penerbangan (TOFMS) sebagai spektrometer jisim dan melakukan "analisis bersepadu" yang menggabungkan pengionan elektron dan pengionan lembut.²⁾. Tambahan pula, dengan menggunakan perisian analisis struktur automatik bernama "msFineAnalysis AI" yang menggunakan kecerdasan buatan (AI) untuk meramalkan spektrum jisim EI daripada struktur kimia, adalah mungkin untuk menganggarkan formula struktur.³⁾.
Dalam MSTips ini, kami akan melaporkan hasil analisis metabolit yang tidak disasarkan dalam sake menggunakan spektrometri jisim masa penerbangan kromatografi gas (GC-TOFMS).

Eksperimen

Derivatisasi

Empat jenis sake dengan klasifikasi komersial yang berbeza (Daiginjo-shu, Junmai-shu, Honjozo-shu, dan Nigori-shu) digunakan sebagai sampel. Mengenai Nigori-shu ia telah disentrifugasi (4 ℃, 10 min, 12,000 rpm), dan hanya supernatan digunakan sebagai sampel. Kami juga menyediakan sampel Semakan Kualiti (QC) di mana semua sampel dicampur dalam jumlah yang sama. Kepada 20 µL setiap sampel, 10 µL larutan metanol asid sinapic 1 mg/mL telah ditambah sebagai piawai dalaman dan dicampur. Seterusnya, ia dikeringkan dalam penyejat dan dibiarkan semalaman dalam desikator. Keesokan harinya, 100 µL 20 mg/mL larutan methoxyamine hydrochloride pyridine telah ditambah kepada setiap sampel dan digoncang dengan thermoshaker (30 ℃, 90 min, 1200 rpm). Selepas itu, 50 µL N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide (MSTFA) ditambah, dan campuran dipanaskan dan digoncang dengan thermoshaker sekali lagi (37 ℃, 30 min, 1200 rpm).

Pengukuran GC-MS

GC-TOFMS (JMS-T2000GC AccuTOF™ GC-Alpha, JEOL Ltd.) telah digunakan untuk pengukuran. Kami menggunakan kedua-dua mod EI dan pengionan medan (FI) dengan gabungan sumber ion EI/FI/FD. Bagi setiap sampel, n=3 pengukuran dilakukan menggunakan EI, dan n=1 pengukuran dilakukan menggunakan FI. Syarat terperinci lain ditunjukkan dalam Jadual 1.

Pemprosesan data

Data EI telah ditukar kepada format biasa GC-MS netCDF. Data ini dianalisis menggunakan program analisis metabolomik MS-DIAL (Ver. 4.9, RIKEN) untuk mengesan puncak dan mengenal pasti sebatian. Untuk pengecaman kompaun, msFineAnalysis AI (JEOL Ltd.), yang boleh menyepadukan dan menganalisis data EI dan FI, telah digunakan untuk mengenal pasti puncak dengan ketepatan yang lebih tinggi dan mengelakkan kesilapan pengecaman. Selepas pengecaman kompaun, kami menormalkan setiap puncak mengikut piawaian dalaman dan LOWESS, dan keamatan puncak setiap sampel telah dieksport. Analisis multivariate kemudiannya dilakukan dalam MetaboAnalyst 6.0 ⁴⁾. Untuk analisis multivariate, analisis komponen utama dan analisis kelompok hierarki telah dilakukan selepas normalisasi dengan AutoScaling.

Jadual 1 Keadaan ukuran GC-MS

Keputusan dan perbincangan

Keputusan perbandingan TICC

Rajah 1 menunjukkan TICC data EI. Banyak sebatian khusus untuk sake dikesan dalam setiap sampel, termasuk gula alkohol seperti gliserol dan gliseril glukosida, gula seperti glukosa, asid amino, asid organik. Oleh kerana keamatan puncak setiap komponen berbeza dari sampel ke sampel, analisis multivariate telah dilakukan.

＊： Luaran m/z kalibran

Rajah 1 TICC metabolit dalam sake

Analisis komponen utama

Rajah 2 menunjukkan keputusan Analisis Komponen Utama (PCA) yang dilakukan oleh MetaboAnalyst terhadap data yang dinormalkan oleh LOWESS dan standard dalaman. Plot skor dalam Rajah 2-A menunjukkan bahawa skor positif dan negatif komponen utama pertama (PC1) boleh mengklasifikasikan Junmai-shu dan lain-lain. Ini mungkin menunjukkan perbezaan disebabkan sama ada alkohol suling ditambah semasa pengeluaran sake atau tidak. Di samping itu, adalah mungkin untuk mengklasifikasikan Daiginjo-shu dan lain-lain berdasarkan skor positif dan negatif komponen utama kedua (PC2). Ini diandaikan disebabkan oleh perbezaan kadar penggilapan beras. Ambil perhatian bahawa klasifikasi Nigori-shu tidak ditulis pada botol. Walau bagaimanapun, Nigori-shu telah diplot berhampiran Honjozo-shu dan mungkin mempunyai ciri-ciri yang serupa.

Rajah 2 Keputusan analisis komponen utama (A) Plot skor, (B) Plot memuatkan

Keputusan Analisis Kluster Hierarki (HCA).

Peta haba hasil Analisis Kluster Hierarki (HCA) ditunjukkan dalam rajah 3. Peta haba menunjukkan kelimpahan setiap komponen mengikut warna (merah: tinggi, biru: rendah), menjadikannya mungkin untuk menggambarkan ciri sebatian setiap sampel. Sebagai contoh, hasil perbandingan keamatan puncak bagi ciri sebatian prolin dan valine dalam Junmai-shu ditunjukkan dalam Rajah 4. Asid amino prolin dan valine adalah komponen kepahitan yang diketahui bagi sake5). Junmai-shu dibuat hanya dengan beras, kome-koji, dan air, dan tidak mengandungi alkohol suling. Oleh itu, ia secara umumnya dikatakan mempunyai rasa yang membolehkan anda merasai rasa dan kekayaan nasi. Ada kemungkinan valine dan proline berkaitan dengan rasa unik Junmai-shu yang diukur kali ini.

Rajah 3 Keputusan Analisis Kluster Hierarki (HCA).

Rajah 4 Keputusan perbandingan keamatan puncak
(A) Proline, (B) Valine

Hasil analisis struktur AI bagi sebatian yang tidak diketahui

Dalam kerja ini, beberapa kompaun yang tidak didaftarkan dalam DB perpustakaan telah dikesan. Sebagai contoh, kami akan menerangkan analisis bersepadu dan keputusan analisis struktur untuk RT puncak 17.82 min dalam Rajah 2. Spektrum jisim sebatian ini dalam Honjozo-shu ditunjukkan Rajah 5. Ion molekul m/z 947 hanya dikesan oleh pengionan lembut FI dan bukan oleh EI. Formula molekul dianggarkan sebagai C₃₇H₈₉TIDAK₁₁Si₈ daripada hasil anggaran komposisi unsur ion molekul dalam FI. Formula molekul ini dianggap berasal daripada oksim dan derivatisasi TMS bagi disakarida penurun. Walau bagaimanapun, nilai RI sebatian dengan formula molekul yang sepadan dan hit No. 1 dalam perpustakaan DB (β-gentiobiose, octakis(trimethylsilyl) eter, methyloxime (isomer 1)) mempunyai perbezaan yang besar dalam nilai RI Δ169 ( Jadual 2). Oleh itu, komponen ini dianggap sebagai komponen tidak berdaftar dalam DB Perpustakaan, walaupun formula molekulnya ialah C₃₇H₈₉TIDAK₁₁Si₈. Rajah 6 menunjukkan hasil analisis struktur AI bagi sebatian ini. Calon pertama ialah terbitan isomaltulosa disakarida. Oleh kerana terbitan isomaltulosa belum didaftarkan dalam pustaka NIST, ada kemungkinan komponen ini adalah isomaltulosa.
Dalam laporan ini, FI dapat mengesan dengan jelas ion molekul walaupun untuk komponen berjisim tinggi yang sukar dianalisis dengan analisis metabolomik menggunakan EI. Tambahan pula, adalah mungkin untuk menganggarkan formula struktur walaupun ia belum didaftarkan dalam DB perpustakaan.

Rajah 5 Spektrum jisim sebatian yang tidak diketahui

Jadual 2 Keputusan analisis kualitatif bersepadu bagi sebatian yang tidak diketahui

Rajah 6 Hasil analisis struktur AI bagi sebatian yang tidak diketahui

kesimpulan

Dalam MSTips ini, kami memperkenalkan keputusan analisis metabolit yang tidak disasarkan dalam sake menggunakan spektrometri jisim masa penerbangan kromatografi gas (GC-TOFMS). Malah metabolit yang sangat polar yang sukar diukur menggunakan pengukuran GC-MS konvensional boleh diukur dengan mudah melalui derivatisasi TMS. Selain itu, analisis multivariate telah memungkinkan untuk mengklasifikasikan sake. Walaupun untuk derivatif disakarida TMS, yang sukar diukur oleh GC-QMS kerana berat molekulnya yang besar, kami dapat mengukur ion molekul menggunakan GC-TOFMS dan FI . Untuk kompaun yang belum didaftarkan dalam perpustakaan DB, kami dapat menganggarkan formula strukturnya menggunakan perisian analisis struktur kompaun yang tidak diketahui msFineAnalysis AI.
Daripada keputusan di atas, telah disahkan bahawa GC-TOFMS dan msFineAnalysis AI berkesan dalam bidang metabolomik menggunakan GC-MS.

Rujukan

1) Agensi Cukai Negara JEPUN. 2023. Gambaran keseluruhan "Piawaian paparan kualiti kaedah pembuatan sake".
https://www.nta.go.jp/taxes/sake/hyoji/seishu/gaiyo/02.htm (Ditulis dalam bahasa Jepun)
2) M. Ubukata et al, Rapid Commun Mass Spectrom. 2020; 34:e8820.
3) A. kubo et al, Spektrometri Jisim, 2023, 12, A0120.
4) MetaboAnalyst 6.0. https://metaboanalyst.ca/
5) Haruo Ogawa. Bahan-bahan dan perisa sake Jepun. Journal of Japan Association on Odor Environment Vol., Jilid 46, Isu 5, 2015年. (Ditulis dalam bahasa Jepun)

Rumusan berdasarkan bidang

Kimia

Biologi / Sains hayat

Makanan/Tumbuhan

Lebih Banyak Produk

JMS-T2000GC AccuTOF™ GC-AlphaKromatografi Gas Berprestasi Tinggi- Spektrometer Jisim Masa-Penerbangan

msFineAnalysis AIUnknown CompoundsStructure Analysis Software

Kategori produk

GC-MS