Menjadikan MicroED, Alat Terbaik untuk Penentuan Struktur Kristal, Lebih Mudah Digunakan!

TEMUDUGA 16

Naruhiko Adachi
Profesor Madya
Pusat Sains Hayat untuk Dinamik Kemandirian,
Perikatan Penyelidikan Lanjutan Tsukuba (TARA),
Universiti Tsukuba

Satu kaedah untuk menjelaskan struktur hablur yang lebih kecil daripada 1 µm - terlalu kecil untuk dianalisis walaupun dengan sinar-X sinkrotron - telah dicadangkan oleh beberapa penyelidik dalam jangka masa 2013-2015, menggunakan data pembelauan elektron. Ini ialah kaedah MicroED (Pembelauan Elektron Mikro) menggunakan cryo-EM (mikroskop cryo-elektron), satu teknik terobosan yang membolehkan pemerhatian struktur kimia dalam spesimen di mana hablur surih dan polimorfik hadir buat kali pertama. Profesor Madya Naruhiko Adachi dari Pusat Sains Hayat untuk Dinamik Kemandirian di Tsukuba Advanced Research Alliance (TARA) telah mempromosikan penggunaan cryo-EM bersama sebagai instrumen khusus untuk MicroED, sambil berusaha untuk mewujudkan aliran kerja pembelauan elektron.

Instrumen Khusus MicroED Ditubuhkan di TARA!

Pada tahun 2018, krio-EM telah diperkenalkan kepada Organisasi Penyelidikan Pemecut Tenaga Tinggi (KEK), Perbadanan Institut Penyelidikan Antara Universiti, yang dianggotai oleh penolong profesor (ketika itu) Naruhiko Adachi yang dilantik khas, yang telah menjalankan penyelidikan tentang pengawalaturan ekspresi gen. Memandangkan beliau mempunyai pengalaman menggunakan krio-EM di kemudahan lain, beliau diamanahkan untuk menguruskan instrumen tersebut. Beliau berusaha untuk memperluaskan penggunaan analisis zarah tunggal dengan menyediakan manual untuk aliran kerja. Mulai tahun 2019, beliau juga mula mengusahakan MicroED dan cuba memperkenalkan eksperimen MicroED dengan kerjasama pakar dalam analisis struktur kristal sinar-X di KEK, Yusuke Yamada, yang ketika itu Penolong Profesor. Berikutan itu, pada tahun 2023, Dr. Adachi mengambil jawatan profesor madya di TARA di mana dua krio-EM (CRYO ARM™ 300 II dan CRYO ARM™ 200 yang dibuat oleh JEOL Ltd.) telah dipasang. Sejak itu, beliau telah memperkenalkan eksperimen MicroED dan mengumpul eksperimen pengukuran secara berterusan.

"Apabila saya menyertai TARA pada tahun 2023, Dr. Iwasaki dan Dr. Harada di TARA telah pun mengendalikan CRYO ARM™ 300 II untuk analisis zarah tunggal. CRYO ARM™ 200 yang telah dipasang pada masa yang sama telah disediakan untuk kami gunakan sebagai instrumen MicroED khusus."

Pengukuran MicroED Lancar dengan Instrumen Khusus

MicroED di TARA mempunyai dua ciri tersendiri:
Salah satunya ialah CRYO ARM 200 dikendalikan sebagai instrumen khusus untuk MicroED. Walaupun boleh menggunakan cryo-EM tunggal untuk analisis zarah tunggal dan pengukuran MicroED, keadaan pengukuran mesti dikonfigurasikan semula setiap kali sistem bertukar antara kedua-dua kaedah tersebut. Oleh kerana analisis zarah tunggal dan MicroED memerlukan keadaan dos elektron yang berbeza, pertukaran antara kedua-duanya mengambil masa yang agak lama. Walau bagaimanapun, di TARA, CRYO ARM 200 telah dikendalikan sebagai instrumen MicroED khusus sejak pemasangannya, membolehkan operasi yang lancar dan cekap. Cryo-EM yang dikongsi dan dikendalikan secara eksklusif untuk MicroED jarang berlaku walaupun pada skala global. Kewujudannya sangat berharga dan mewakili salah satu kekuatan utama TARA.
"Dari perspektif operasi kemudahan, instrumen krio-EM sering diuruskan terutamanya untuk analisis zarah tunggal, yang kekal sebagai teknik pengukuran yang dominan. Akibatnya, terdapat sangat sedikit krio-EM yang dikhaskan secara eksklusif untuk MicroED. Oleh itu, keupayaan untuk mengendalikan CRYO ARM 200 sebagai instrumen MikroED khusus adalah sangat berharga, dari segi kemudahan dan kestabilan operasi."

Kunci kepada Kemudahan Penggunaan - Aliran Kerja Automatik

Ciri tersendiri kedua ialah "kemudahan penggunaannya".
Sudah tentu terdapat permintaan untuk MicroED, yang membolehkan struktur kristal yang sangat kecil, surih dan polimorfik. Walau bagaimanapun, ia tidak semudah analisis zarah tunggal di mana aliran kerja dan perisian sudah mantap. Walau bagaimanapun, Profesor Madya Adachi di TARA mengendalikan permintaan pengukuran MicroED untuk sekitar 40 kumpulan penyelidikan setiap tahun. Apakah mekanisme di sebaliknya?

"Oleh kerana cryo-EM yang kami kendalikan merupakan kemudahan kongsi, ia perlu mudah digunakan oleh pengguna luar. Memandangkan kebanyakan pengguna luar hanya mengaksesnya sekali setiap satu atau dua bulan, penggunaannya perlu semesra pengguna yang mungkin. Untuk tujuan ini, kami percaya bahawa adalah perlu untuk mewujudkan aliran kerja yang seautomatik mungkin dan menyediakan manual yang komprehensif. Walau bagaimanapun, terdapat had kepada apa yang boleh dicapai oleh ahli sesebuah kemudahan secara bersendirian. Jadi, komuniti dalam talian MicroED telah dilancarkan untuk lebih daripada satu kemudahan untuk bekerjasama. Kami memperkenalkan perisian automasi dengan bantuan Dr. Makino dari Universiti Osaka, Dr. Yanagisawa dari Universiti Tokyo, dan Dr. Nakane dari Universiti Osaka. Pemprosesan data yang diukur telah disediakan oleh Dr. Yamada dari Universiti Tohoku dengan bantuan Dr. Nakane dari Universiti Osaka dan lain-lain. Sebaik sahaja sistem analisis untuk pengukuran automatik dan pemprosesan data siap, kami berulang kali menggunakannya dengan instrumen khusus di TARA dan meningkatkan tahap penyiapan, sambil kami juga berusaha menyediakan manual."
Dengan cara ini, kami dapat menyediakan automasi pengukuran dan pemprosesan data serta manual, MicroED di TARA menjadi mudah digunakan walaupun untuk pengguna luar."

Adakah MicroED di TARA Cukup Mudah untuk Pelajar Sarjana Muda Senior sekalipun!?

Menurut usaha tersebut, pelajar juga boleh mengukur kira-kira 200 zarah untuk satu malam, 1000 zarah pada hujung minggu, jika mereka mengikuti aliran kerja MicroED TARA yang telah diautomasikan sebanyak mungkin. Dalam eksperimen, yang memerlukan penentuan kristal guanin ikan, pelajar dalam program sarjana muda senior mereka juga berjaya mencapai pengukuran kira-kira 2000 zarah dalam seminggu. Jarang sekali di seluruh dunia pelajar sarjana muda senior menggunakan sepenuhnya instrumen MicroED dengan instrumen cryo-EM. Ini kerana aliran kerja menggabungkan pengukuran automatik dan pemprosesan data, membolehkan operasi yang stabil dan andal.

Keputusan pengukuran untuk kristal guanina bersama-sama dengan keputusan automasi aliran kerja MicroED sedang dihantar sebagai kertas kerja asal.

"Telah diketahui bahawa sisik ikan berkilat berwarna perak atau biru, kerana terdapat kristal guanina dalam kulit ikan. Tetapi sama ada guanina adalah jenis α atau jenis β, tidak diketahui. Kristal guanina dalam sisik tersebut terlalu kecil untuk menentukan struktur kristal menggunakan pembelauan sinar-X. Pada tahun 2024, didapati bahawa struktur guanina salmon adalah jenis β. Ini membawa kami kepada persoalan sama ada spesies ikan lain juga mempunyai guanina jenis β, atau jenis α, atau mungkin, kristal polimorfik yang terdiri daripada jenis β dan jenis α. Oleh itu, kami memutuskan untuk memeriksa struktur sel pada akar skala untuk ikan saury Pasifik, ikan cutlass, dan ikan sapphire damselfish dengan pelajar sarjana muda senior. MicroED boleh menentukan struktur kristal dengan tepat, walaupun spesimen mempunyai jenis β dan jenis α, kristal polimorfik dicampur, kerana ia memerhatikan kristal individu dalam spesimen. Walau bagaimanapun, sekiranya kristal diambil dari sel, kristal boleh rosak atau bercampur dengan isi ikan. Kita hampir tidak dapat menemui kristal sasaran melainkan kita melakukan banyak pengukuran yang tidak pasti." zarah. Hasil daripada pengukuran kira-kira 2000 zarah, kami dapat mengesahkan kewujudan kristal guanina jenis-β dan jenis-α. Saya fikir ini adalah hasil daripada semangat pelajar yang cemerlang serta automasi pengukuran dan pemprosesan data yang canggih.
Sebagai nota sampingan, saya juga meminta pelajar mendapatkan ikan untuk eksperimen. Apabila ikan kehilangan kesegaran, kristal juga merosot. Jadi, saya pasti pelajar mesti telah membangunkan keupayaan untuk mengenal pasti "sauri Pasifik yang segar dan meriah. (ketawa)"

MicroED Mengisi Jurang dalam Liputan Kaedah Analisis Lain

MicroED boleh mendapatkan data pembelauan walaupun daripada kristal bersaiz kurang daripada 1 µm dalam spesimen yang terdiri daripada kristal surih dan polimorfik. Walau bagaimanapun, adalah sukar untuk mengukur spesimen yang mengandungi campuran pelbagai zarah apabila tidak jelas sama ada kristal sasaran itu hadir. Dengan menggunakan MicroED sahaja, adalah sukar untuk menentukan berapa banyak zarah yang perlu diperhatikan, sama ada 100 atau sehingga 1,000. Dalam kes sedemikian, adalah berkesan untuk memeriksa sama ada kristal sasaran hadir dalam spesimen dengan menggunakan pembelauan sinar-X serbuk, kemudian menganalisis strukturnya dengan MicroED.
Tambahan pula, data yang diukur dengan MicroED mendedahkan struktur (bentuk) molekul tetapi tidak mengenal pasti jenis unsur. MicroED sahaja tidak dapat menganalisis struktur bahan yang tidak diketahui sepenuhnya. Jika formula struktur dan komposisi unsur diketahui, setiap atom boleh dikenal pasti berdasarkannya. Oleh itu, gabungan dengan spektrometri jisim dan NMR adalah berguna. Oleh itu, untuk memanfaatkan MicroED bagi penentuan struktur molekul, adalah penting untuk menggabungkannya dengan kaedah analisis lain.

"Satu kumpulan penyelidikan telah lama berusaha untuk menentukan struktur sebatian yang hanya wujud sebagai kristal kecil dan dalam kuantiti yang sangat kecil, menggunakan kristalografi sinar-X serbuk. Walau bagaimanapun, walaupun selepas dua tahun, mereka tidak dapat mengenal pasti mana-mana struktur. Walaupun menghabiskan sepanjang masa itu untuk meningkatkan kualiti kristal, kristalografi sinar-X serbuk sahaja tidak dapat menyelesaikan mana-mana struktur. Dengan kepintaran mereka, mereka mencuba MicroED di TARA, kemudian mereka berjaya menentukan struktur 10 kristal hanya dalam masa seminggu! Seluruh kumpulan penyelidikan meraikannya seperti perayaan (ketawa). Kami telah mengalami beberapa pengalaman seperti itu. Dengan mengukur spesimen kristal yang dipertingkatkan dengan MicroED, struktur tersebut diselesaikan sekaligus. Ini adalah contoh yang baik tentang apa yang boleh dicapai oleh gabungan kristalografi sinar-X serbuk dan MicroED. Walaupun kekristalan pada mulanya lemah, selagi kristalografi sinar-X serbuk menunjukkan bahawa kristal sasaran ada, kualiti kristal boleh diperbaiki secara beransur-ansur. Kemudian, setiap mikrokristal individu boleh dianalisis satu persatu menggunakan MicroED. Saya fikir aliran kerja seperti ini sangat sesuai untuk MicroED."

Walaupun MicroED mempunyai kekuatan yang inovatif, ia juga mempunyai batasan dalam menganalisis bahan yang tidak diketahui sepenuhnya. Dalam erti kata lain, ini adalah teknologi yang mengisi jurang dalam liputan kaedah analisis struktur tiga dimensi sedia ada. Untuk memaksimumkan keupayaannya, penggunaan pelengkap dengan pembelauan sinar-X serbuk, spektrometri jisim dan NMR adalah sangat berkesan.

Kunci Kejayaan MicroED ialah Mesyuarat dan Kehadiran Terlebih Dahulu semasa Pengukuran

Apabila MicroED digunakan di TARA, mesyuarat awal adalah yang paling penting untuk kejayaan pengukuran. Sebaik-baiknya, pengukuran harus dilakukan berdasarkan pemahaman bersama yang jelas tentang faktor-faktor seperti keadaan dan ciri-ciri spesimen, kepakaran penganalisis data, tujuan analisis, pengetahuan pemohon tentang analisis kristal dan batasan teknikal MicroED.
"Jika kita memulakan pengukuran selepas perkongsian maklumat yang teliti dengan pemohon, kita selalunya akan mendapat pengukuran yang lebih lancar. Sudah tentu, selepas memeriksa apa yang ingin diketahui oleh pemohon, kita kadangkala menolak permintaan pengukuran kerana ia tidak mungkin dilakukan dengan MicroED. Di samping itu, adalah sangat penting bagi seseorang yang biasa dengan spesimen tertentu untuk hadir semasa pengukuran. Ia menyusahkan jika hanya spesimen yang diberikan. Kita tidak tahu banyak tentang spesimen tersebut. Jika sesuatu berlaku semasa pengukuran, kita memerlukan seseorang yang mengenali spesimen dengan baik untuk membuat penilaian bagi pelbagai perkara, bagi memastikan pengukuran berjaya."

Kami Ingin Menubuhkan Pusat Kebangsaan untuk MicroED!

Sejak tahun 2023, Profesor Madya Adachi telah mengusahakan tema "Penyeragaman MikroED melalui Automasi", dengan kerjasama ramai penyelidik. Kami bertanya kepadanya, pakar MikroED yang mengetahui kelebihan dan kekurangannya tentang cita-cita masa depannya.
"MicroED masih merupakan teknologi baharu dan terdapat banyak bidang di mana kami sedang berusaha. Selain memastikan operasi cryo-EM yang lancar di TARA sebagai kemudahan kongsi, kami ingin terus memperhalusi sistem operasi dengan mendengar maklum balas pengguna dengan teliti dalam masa nyata dan menggunakan kelebihan mempunyai instrumen khusus. Kemudian, sama seperti kami telah mengeksport sistem TARA ke institusi penyelidikan lain seperti Universiti Osaka dan SPring-8, kami berharap dapat mengembangkan sistem ini secara aktif ke institusi penyelidikan luar. Akhirnya, kami ingin menubuhkan "Pusat Kebangsaan untuk MicroED" dengan kira-kira 10 cryo-EM pada tahap yang sama seperti TARA, supaya kami dapat menyokong lebih ramai penyelidik pada masa hadapan!"

Maklumat Produk