Analisis ultra pantas struktur 3D protein
― penyediaan sampel untuk cryo-EM dalam 10 minit ―

TEMUDUGA 15

Tsuyoshi Inoue
Makmal Analisis Struktur dan Fungsi Biomolekul
Sekolah Siswazah Sains Farmaseutikal, Universiti Osaka

Struktur 3D biomolekul, seperti protein, menjadi maklumat penting untuk penyelidikan dan pembangunan biokimia dan penemuan ubat. Walaupun kaedah analisis menggunakan cryo-EM adalah meluas, satu alat untuk meningkatkan kelajuan kerja analisis secara dramatik, "EG-grid™" telah dibangunkan oleh Prof. Inoue. Kami telah menemu bual Prof. Inoue tentang ciri-cirinya.

Penembusan Pantas cryo-EM

Sebagai kaedah untuk analisis struktur 3D protein, mikroskopi krio-elektron (krio-EM) telah tersebar dengan pesat. Dalam pangkalan data awam antarabangsa PDB (Bank Data Protein), data struktur 3D biomolekul (protein, asid nukleik, dll.) yang baru dijelaskan didaftarkan dari hari ke hari. Data tersebut didedahkan sebaik sahaja kertas berkaitan dikeluarkan. Antara data struktur yang didedahkan, yang dijelaskan oleh mikroskop elektron mencapai 5,791 dalam setahun pada tahun 2024. Ini merangkumi 37% daripada jumlah data yang didedahkan pada tahun tersebut.

Menurut graf tersebut, data yang menggunakan mikroskop elektron mula meningkat sekitar tahun 2017.
Tahun ini, tiga penyelidik yang membangunkan teknologi asas mikroskop krio-elektron telah dianugerahkan Hadiah Nobel dalam Kimia. "Dicetuskan oleh hadiah Nobel, kesedaran tentang krio-EM dan kaedahnya telah meningkat, sekali gus mempercepatkan penggunaannya", kata Prof. Tsuyoshi Inoue (Sekolah Siswazah Sains Farmaseutikal, Universiti Osaka).
Sebab populariti krio-EM adalah kerana penghabluran protein, yang dahulunya merupakan proses yang tidak dapat dielakkan dalam analisis struktur kristal sinar-X, tidak diperlukan. Analisis struktur kristal sinar-X merupakan kaedah utama untuk menjelaskan struktur 3D. Walau bagaimanapun, dalam kaedah ini, protein perlu dibuat menjadi kristal besar kira-kira 100 μm. Penyediaan sampel mengambil masa beberapa bulan atau lebih. Selain itu, terdapat protein dan kompleks yang sukar dikristalisasi. Krio-EM boleh menganalisis protein yang sukar dikristalisasi, yang merupakan kelebihan krio-EM.
Tambahan pula, analisis adalah mungkin walaupun hanya terdapat sedikit jumlah sampel yang tersedia, yang merupakan satu lagi kelebihan besar. Analisis struktur yang mencabar menjadi mudah walaupun untuk protein yang penulenannya sukar dan kompleks yang tidak stabil dan cenderung untuk mengagregat dengan mudah.

Penyediaan sampel dalam sebulan walaupun untuk cryo-EM

Jadi, adakah cryo-EM memerlukan sebarang pemprosesan? Ya, memang memerlukannya. Pada peringkat awal, penyediaan sampel dan pengambilan mikrograf elektron mengambil sedikit masa.

Untuk analisis struktur 3D, kaedah analisis zarah tunggal digunakan. Dalam kaedah ini, banyak imej zarah tunggal diskret diambil oleh cryo-EM. Untuk meningkatkan ketepatan, banyak imej yang diambil dari pelbagai sudut perlu disediakan dan ia dibina semula menjadi struktur 3D menggunakan komputer. Untuk tujuan ini, adalah perlu untuk menyediakan sampel yang sesuai yang membolehkan pemerolehan imej yang cekap, sekali gus meningkatkan kelajuan penyelidikan keseluruhan.

Untuk menyediakan sampel, kaedah pembenaman ais secara tradisinya digunakan. Ini adalah kaedah untuk membekukan larutan dengan cepat bagi membenamkan protein dalam ais amorfus. Walau bagaimanapun, kaedah ini memberikan cabaran dalam melaraskan kepekatan. Jika kepekatannya terlalu tinggi, zarah akan bertindih dan imej yang boleh digunakan tidak dapat diperoleh. Sebaliknya, jika kepekatannya terlalu rendah, bilangan zarah akan berkurangan dan kecekapan pengimejan akan berkurangan. Di samping itu, jika ais tebal dan zarah protein diagihkan dalam arah ketebalan, bilangan zarah yang boleh difokuskan adalah terhad, seterusnya mengurangkan kecekapan pengimejan.

"Melaraskan kepekatan adalah perkara yang sukar. Walau bagaimanapun, masalah paling kritikal dalam kaedah pembenaman ais ialah orientasi yang diutamakan, di mana protein sejajar dalam arah yang sama!" (Prof. Inoue)

Orientasi pilihan dijana semasa proses pembekuan. Tetapi dalam beberapa kes, orientasi ke arah yang sama berlaku sebelum pembekuan. Ini adalah kes di mana protein yang sangat hidrofobik melekat pada antara muka gas-cecair, menghasilkan orientasi dalam arah yang sama. Dalam kaedah penyediaan sampel konvensional, ia mungkin mengambil masa sebulan untuk mempertimbangkan keadaan ini.

Prof. Inoue dan lain-lain berjaya membangunkan alat penyediaan sampel, "EG-grid™ (Epoxidized Graphen Grid)", penyelesaian yang hebat untuk isu-isu tersebut. EG-grid™ ialah tapak sokongan yang diperbuat daripada kumpulan epoksi yang mengandungi grafena. Memandangkan kumpulan epoksi mempunyai sifat untuk menangkap residu lisina yang wujud pada permukaan zarah protein, zarah protein dilekatkan pada pelbagai sudut. Ketumpatan kumpulan epoksi telah ditetapkan dengan betul, jadi tidak perlu risau tentang pelarasan kepekatan larutan. Tiada taburan dalam arah ketebalan, membolehkan pemfokusan yang sesuai pada pengimejan.

Dengan menggunakan EG-grid™, masa penyediaan sampel yang sebelum ini mengambil masa hampir sebulan telah dikurangkan kepada kira-kira 10-15 minit. Sampel boleh ditetapkan pada mikroskop krio-elektron dalam masa 20 minit termasuk proses pembekuan.

Kecekapan pengimejan juga telah bertambah baik. Bilangan zarah yang boleh digunakan yang diperoleh daripada satu penggambaran telah meningkat berbanding kaedah terbenam ais, sekali gus mengurangkan jumlah imej yang diperlukan. Bagi sesetengah protein, analisis juga boleh diselesaikan dengan hanya sepersepuluh atau sepersepuluh daripada bilangan imej konvensional.

Pembangunan yang dicetuskan oleh "disinfektan/deodoran misteri"

Pembangunan EG-grid™ bermula dengan pertemuan dengan "disinfektan/deodoran misteri".

Pada tahun 2015, satu pertanyaan telah diajukan kepada Universiti Osaka. "Apabila seorang pesakit kanser mulut terminal menggunakan disinfektan/deodoran ini untuk mengawal bau, kanser tersebut kelihatan merosot. Bolehkah anda menyiasat mekanisme yang mendasarinya? Jika kesannya benar, kami ingin mengubahnya menjadi ubat antikanser." Bersamaan dengan permintaan ini, sebotol "air misteri" telah diserahkan.
Kami bertanya, "Apakah bahan-bahannya?" Jawapannya hanyalah, "Kami tidak boleh mendedahkannya."
Ia kedengaran agak meragukan. Walau bagaimanapun, apabila analisis itu diamanahkan kepada Prof. Shunichi Fukuzumi dari Sekolah Siswazah Kejuruteraan (pada masa itu), seorang pakar dalam radikal dengan cepat mengenal pasti komponen utama dan mekanisme yang mendasarinya.

Komponen utamanya ialah ion klorit (ClO₂-). Ternyata ion ini (ClO₂-) menghasilkan klorin dioksida reaktif (ClO₂) di dalam air sebanyak yang diperlukan hanya apabila terdapat bakteria dan virus sasaran yang wujud - inilah mekanismenya.

Kemudian, Universiti Osaka memutuskan untuk menamakan "air" yang sangat selamat ini sebagai MA-T: Sistem Transformasi Padanan. Ini adalah untuk mengelakkan kekeliruan dengan bahan lain yang boleh menghasilkan gas berasaskan klorin.

Prof. Ohkubo (pada masa itu) yang dilantik khas yang mengendalikan analisis dalam kumpulan penyelidikan yang sama dengan Prof. Fukuzumi, merupakan pakar dalam fotokimia. Beliau menjadi tertarik: "Apa yang akan berlaku jika kita menyinari dengan cahaya pada benda ini?" Di bawah keadaan berasid, beliau melepaskan klorin dioksida sebagai gas dan mendedahkannya kepada cahaya. Beliau mendapati bahawa ia berpecah kepada spesies oksigen reaktif dan radikal klorin. Beliau selanjutnya mendapati bahawa penggunaan spesies oksigen reaktif dan radikal klorin ini boleh mengoksidakan pelbagai bahan.

Contohnya, pengoksidaan metana menghasilkan metanol dan asid formik. Tiada pelepasan karbon dioksida. Ia merupakan kali pertama di dunia mensintesis metanol di bawah keadaan suhu dan tekanan normal. Metana boleh diperoleh melalui penapaian najis lembu, atau di tapak pengumpulan petroleum dan gas asli tetapi sukar untuk diangkut. Walau bagaimanapun, dengan menjadikannya metanol cecair dan asid formik, pengangkutan menjadi mudah, dan penggunaannya berkembang.

EG-grid™ adalah hasil daripada penggunaan tindak balas pengoksidaan tersebut ke dalam cryo-EM. Jika permukaan grafena dioksidakan untuk menanggung kumpulan hidroksil (-OH), kumpulan berfungsi yang boleh melumpuhkan protein boleh digantikan di sana. Idea ini telah dibawa ke dalam pembangunan EG-grid™.
Oleh itu, Prof. Inoue berpendapat bahawa tindak balas pengoksidaan yang baru ditemui dan MA-T yang sangat selamat boleh digunakan untuk pelbagai kegunaan, dan beliau memohon OPERA (Program Platform Inovasi Terbuka dengan Perusahaan, Institut Penyelidikan dan Akademia oleh JST (Agensi Sains dan Teknologi Jepun) untuk penyelidikan lanjut mengenai aplikasi praktikal. Walau bagaimanapun, agar permohonan itu diterima pakai, sejumlah besar pembiayaan penyelidikan bersama diperlukan. Tarikh akhir adalah kurang daripada tiga bulan lagi. Salah satu syarikat yang memberi respons kepada rayuan segeranya ialah JEOL Ltd.

JEOL telah menubuhkan "Makmal Perikatan Penyelidikan Universiti Osaka-JEOL YOKOGUSHI" pada tahun 2018, dan oleh itu pembiayaan penyelidikan disediakan daripada makmal-makmal ini. Cadangan Prof. Inoue telah berjaya diterima pakai untuk OPERA (untuk tempoh Oktober 2019 hingga Mac 2024).
Ini membolehkan pembangunan EG-grid™ dan sokongan projek oleh JEOL. CRYO ARM™ 200 yang dipasang di makmal pada masa yang sama.

Projek OPERA ini telah membawa banyak hasil dan dinilai tinggi. Pada Februari 2024, ia memenangi anugerah Perdana Menteri daripada 6^th Hadiah Inovasi Terbuka Jepun. Penyelidikan mengenai pengoksidaan metana telah menerima Penghargaan untuk Sains dan Teknologi oleh Menteri Pendidikan, Kebudayaan, Sukan, Sains dan Teknologi pada April 2024. Usaha mereka juga telah diambil kira dalam cadangan Majlis Sains Jepun "kekuatan kolektif industri, kerajaan, ahli akademik dan orang ramai untuk menangani krisis iklim" (dikeluarkan pada Oktober 2025).

Banyak paten telah diperoleh. Dicetuskan oleh suara daripada lebih daripada satu syarikat untuk menggunakan paten, Persatuan Perindustrian MA-T Jepun telah ditubuhkan (November 2020). Bilangan syarikat ahli mencecah 91, dengan ahli sokongan dalam 22 syarikat/organisasi (sehingga Januari 2025). Di EXPO 2025, Osaka, Kansai, MA-T telah menubuhkan sebuah gerai di "Osaka Healthcare Pavilion" dan mempamerkan produk penjagaan mulut untuk manusia dan haiwan peliharaan, produk penjagaan alam sekitar jenis taburan/semburan ruang. Kedua-duanya menghasilkan pameran potensi keselamatan tinggi MA-T.

Liputan Cryo-EM semakin meluas

Pada masa ini, produk saudara EG-grid™, iaitu produk dengan kumpulan berfungsi lain dan bukannya kumpulan epoksi, sedang dipertimbangkan. Apabila asid klorida (sebatian klorin) dilekatkan, ia akan mengikat protein (kumpulan amino dan kumpulan tiol) lebih cepat daripada kumpulan epoksi. Walau bagaimanapun, sukar untuk mengendalikannya: pemasaran di seluruh dunia tidak mungkin dilakukan. "Adakah mungkin untuk melumpuhkan protein dengan tag His?" - untuk bertindak balas terhadap suara sedemikian, beberapa prototaip telah pun dibangunkan. Walau bagaimanapun, semua protein berorientasikan ke arah yang sama, yang merupakan satu kelemahan. "Walaupun begitu, memandangkan kita boleh menangkap imej dari sudut yang berbeza daripada orientasi yang diutamakan, ia boleh berfungsi sebagai penyelesaian yang lebih berkesan." (Prof. Inoue).

Apabila titik lemah gabungan analisis krio-EM dan zarah tunggal dicari, ia tidak bagus untuk protein kecil. Pada masa lalu, dikatakan bahawa ia perlu 100,000 Da(*) atau lebih besar. Walau bagaimanapun, analisis boleh dilakukan terhadap protein 50,000 hingga 60,000 Da sekarang. Liputan analisis struktur 3D dengan menggunakan krio-EM telah berkembang dengan lebih meluas.

*Da (Dalton): Unit jisim yang ditakrifkan sebagai satu perdua belas jisim atom karbon-12.

"Apabila analisis struktur kristal sinar-X merupakan satu-satunya pilihan, kami sering bimbang sama ada protein ini boleh membentuk kristal, dan jika ya, bilakah ia mungkin berlaku?" (Prof. Inoue). Kini, cryo-EM telah menjadi pilihan pertama, membolehkan analisis segera untuk protein dengan jisim tertentu.

Permintaan untuk EG-grid™ sedang melonjak sekarang.