Analisis COSY/TOCSY│Mentafsir korelasi spin menggunakan NMR 2D

Dalam ruangan ini, kami menerangkan prinsip asas dan kaedah analisis COSY dan TOCSY, yang merupakan teknik perwakilan NMR 2D. Bermula daripada mengesahkan korelasi antara proton bersebelahan menggunakan COSY, kami memperkenalkan analisis rangkaian spin dengan TOCSY dan analisis karbohidrat menggunakan TOCSY 1D dan 2D, berserta contoh konkrit.

Apakah itu COSY?

COSY (Spektroskopi KORELASI) ialah kaedah asas untuk menggambarkan gandingan antara bersebelahan ¹Hs dengan menggunakan NMR 2D. Secara tradisinya, homodegandingan bagi ¹Hs digunakan untuk mencari lokasi jiran ¹Atom H satu persatu. Walau bagaimanapun, dengan kemunculan COZY, ia menjadi mungkin untuk menganalisis ¹H-¹Korelasi gandingan H secara serentak dalam julat yang luas, meningkatkan kecekapan analisis struktur secara mendadak. Pada masa ini, COZY digunakan secara meluas sebagai kaedah pengenalan NMR 2D untuk mengesahkan ¹H-¹Korelasi H.

Rajah 1 menunjukkan spektrum COZY untuk kawasan yang sepadan dengan ¹Hs pada 1 hingga 6 dalam "asid sinamik cis-3-heksenil ester". Seperti yang ditunjukkan di atas, apabila isyarat korelasi dan ¹Spektrum H bagi 1D pada kedua-dua paksi disambungkan, 5 korelasi boleh diperhatikan: 1-2, 2-3, 3-4, 4-5, dan 5-6. Hasilnya membolehkan kita membuat kesimpulan bahawa ¹Hs dari 1 hingga 6 mempunyai struktur bersebelahan setiap satu. Di samping itu, COZY membolehkan kita memahami hubungan antara atom karbon secara tidak langsung daripada maklumat gandingan atom bersebelahan ¹Hs. Maklumat ini amat penting untuk menentukan substruktur.

Walau bagaimanapun, apa yang berlaku apabila spektrum COZY serumit yang terdapat dalam Rajah 2?
Melihat kawasan yang diserlahkan dengan warna hijau, anda dapat melihat bahawa isyarat tersebut bertindih, menjadikannya sukar untuk mengenal pasti korelasi. Dalam situasi ini, meneruskan penentuan struktur nampaknya hampir mustahil.

Untuk sebatian seperti polisakarida atau molekul siklik, di mana ¹Isyarat H yang padat muncul dalam julat yang sempit seperti dalam Rajah 2, bergantung pada COZY sahaja boleh menyebabkan kebuntuan dalam analisis struktur.

Satu penyelesaian untuk situasi apabila COZY tidak dapat dianalisis dengan secukupnya ialah TOCSY.
Kami akan menerangkan TOCSY dalam bahagian seterusnya.

Apakah TOCSY?

TOCSY（Spektroskopi Korelasi Total） ialah teknik NMR 2D yang membolehkan anda menggambarkan semua ¹Hs yang tergolong dalam rangkaian spin yang sama pada masa yang sama. Oleh kerana gandingan spin merambat melalui rangkaian, TOCSY bukan sahaja mendedahkan kedudukan bersebelahan tetapi juga korelasi merentasi keseluruhan sistem spin, menjadikannya sangat berkesan untuk menganalisis molekul organik kompleks, gula dan asid amino. TOCSY juga dikenali sebagai HOHAHA (spektroskopi HOmonuklear HArtmann-HAhn), yang pada asasnya merujuk kepada eksperimen yang sama.

Contohnya, andaikan terdapat sambungan atom seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3. H_A・H_B・H_C・H_D disambungkan melalui gandingan spin antara jiran ¹Hs, dan sambungan ini dipanggil sistem spin (rangkaian spin). Sistem spin tidak merambat melalui karbon kuaterner tanpa H atau ¹H digandingkan melalui oksigen, jadi rangkaian terganggu pada titik-titik ini. TOCSY membolehkan kita memerhatikan korelasi antara nukleus dalam sistem spin yang sama walaupun ia tidak digandingkan secara langsung--contohnya, antara ¹H_A dan ¹H_DDalam TOCSY, kemagnetan dipindahkan langkah demi langkah: dari H_A ke H_B, kemudian dari H_B ke H_C, dan akhirnya dari H_C ke H_DDalam erti kata lain, kemagnetan bergerak melalui sistem putaran, menghubungkan segala-galanya di sepanjang jalan. Pemindahan kemagnetan ini dipanggil "relay". TOCSY memerhatikan isyarat korelasi berdasarkan relay ini.

Rajah 4 menunjukkan jujukan denyut untuk COSY dan TOCSY. COSY menggunakan dua denyut 90°, manakala dengan TOCSY, denyut kedua ialah denyut kunci putaran. Tempoh denyut kunci putaran ini dipanggil "masa pencampuran", yang merupakan parameter utama dengan TOCSY. Dengan meningkatkan masa pencampuran, anda boleh memerhatikan isyarat korelasi yang telah disampaikan pada jarak yang lebih jauh dalam sistem putaran.

Masa pencampuran dan isyarat korelasi TOCSY

Rajah 5 menunjukkan gambarajah skematik spektrum TOCSY bagi sebatian yang mempunyai dua rangkaian spin bebas. Setiap rangkaian spin dinyatakan dalam warna kuning dan hijau. Seperti yang ditunjukkan, TOCSY memerhatikan korelasi semua ¹H yang dimiliki oleh setiap rangkaian spin. Pada masa itu, jika isyarat seperti "A" dan "a" dalam spektrum primer pada kedua-dua paksi muncul jauh dari kawasan di mana isyarat muncul padat, isyarat tersebut mudah dikelaskan secara berasingan dalam rangkaian kuning dan hijau, membolehkan pengesahan setiap rangkaian spin.

Seterusnya, mari kita lihat bagaimana isyarat korelasi A berubah apabila masa pencampuran diubah.
Rajah 6 ialah pandangan yang diperbesarkan bagi korelasi A daripada gambarajah skematik TOCSY dalam Rajah 5.
Dengan masa pencampuran yang singkat, kemagnetan bagi ¹H_A hanya bergerak ke kawasan jiran ¹H_B, dan isyarat korelasi B dengan ¹H_B muncul.
Apabila masa pencampuran ditambah lagi, kemagnetan bergerak ke ¹H_C, dan isyarat korelasi C muncul. Apabila masa pencampuran ditingkatkan lagi, kemagnetan bergerak ke ¹H_D, dan isyarat korelasi D muncul. Hasilnya, menjadi jelas bahawa terdapat hubungan antara ¹H_A - ¹H_B - ¹H_C - ¹H_D.

Lebih lama masa pencampuran, lebih jauh kemagnetan boleh bergerak. Oleh itu, jika masa pencampuran yang cukup lama digunakan, kemagnetan boleh dipindahkan melalui semua ¹Hs dalam sistem spin yang sama, membolehkan pengesanan isyarat korelasi untuk semua ¹Hs dalam sistem putaran itu.
Tambahan pula, dengan membandingkan spektrum yang diperoleh dengan masa pencampuran yang berbeza, susunan berjujukan bagi ¹Sambungan H juga boleh diketahui.

Contoh analisis untuk sukrosa menggunakan TOCSY 2D

Di sini, kami membentangkan contoh analisis sukrosa menggunakan 2D TOCSY. Sukrosa ialah disakarida yang terdiri daripada glukosa dan fruktosa yang dikaitkan oleh ikatan glikosidik. Sukrosa mengandungi sejumlah 22 ¹Hs, tetapi memandangkan sampel dilarutkan dalam air berat, ¹H bagi kumpulan hidroksil (-OH) tidak diperhatikan disebabkan oleh pertukaran deuterium. Oleh itu, dalam kes ini, 14 ¹H diperhatikan, tidak termasuk 8 ¹Hs bagi kumpulan hidroksil.

Biar kami tunjukkan spektrum sukrosa COSY dalam Rajah 7. Bahagian yang diserlahkan dalam bingkai merah dibesarkan dan ditunjukkan dalam Rajah 8.

Dalam Rajah 7, enam isyarat korelasi boleh didapati dengan agak mudah.
Walau bagaimanapun, adalah sukar untuk mentafsir korelasi isyarat yang muncul di kawasan di mana anjakan kimia berdekatan antara satu sama lain, seperti yang ditunjukkan oleh bulatan merah dalam Rajah 8. Ramai orang mungkin tersekat pada ketika ini dalam analisis.
Oleh itu, kita akan cuba menggunakan kaedah TOCSY.

Rajah 9 Spektrum TOCSY diukur dengan masa pencampuran ditetapkan kepada 20 ms dan 150 ms

Rajah 9 menunjukkan spektrum TOCSY yang diukur dengan masa pencampuran yang ditetapkan masing-masing kepada 20 ms dan 150 ms. Pertama, kita fokus pada isyarat korelasi bagi ¹H pada kedudukan anomerik glukosa, yang muncul pada anjakan kimia yang jauh dari isyarat lain. Seperti yang ditunjukkan sebelum ini dalam Rajah 6, kita akan mengkaji bagaimana isyarat korelasi berubah dengan masa pencampuran yang berbeza, untuk mengesahkan maklumat geganti daripada ¹H pada kedudukan anomerik. Ia juga boleh diperhatikan bahawa lebih banyak isyarat korelasi muncul apabila masa pencampuran meningkat. Tambahan pula, bagi kawasan di mana isyarat bertindih, adalah lebih mudah untuk membandingkan dengan menggunakan data yang dihiris dan bukannya spektrum 2D. Oleh itu, kita akan membandingkan setiap spektrum 1D yang diperoleh dengan mengekstrak hirisan di sepanjang paksi-X (di kawasan yang ditunjukkan oleh bingkai hijau) untuk pengesahan isyarat korelasi bagi ¹H.

Spektrum teratas dalam Rajah 10 menunjukkan konvensional ¹Spektrum H. Di bawahnya terdapat data hirisan yang diperoleh dengan masa pencampuran yang diubah dari 20 ms hingga 200 ms. Isyarat di sebelah kiri sepadan dengan Glu H-1, yang kami anggap sebagai titik permulaan geganti. Pada masa pencampuran 20 ms, hanya korelasi dengan Glu H-2 bersebelahan yang muncul, hanya mendedahkan hubungan antara kedudukan 1 dan 2. Apabila masa pencampuran meningkat, isyarat korelasi muncul secara berurutan, dan akhirnya, sambungan dari kedudukan 1 ke kedudukan 6 dalam bahagian glukosa dapat disahkan. Walaupun sukar untuk mengenal pasti rakan korelasi Glu H-5 dengan jelas menggunakan COZY, TOCSY memberikan maklumat ini.

Seterusnya, mari kita periksa geganti yang bermula dari Fru H-3′.
Seperti bahagian sukrosa, Rajah 11 menunjukkan spektrum TOCSY yang diperoleh dengan masa pencampuran yang berbeza.

Rajah 11. Spektrum TOCSY diukur dengan masa pencampuran ditetapkan kepada 20 ms dan 150 ms

Seperti sebelum ini, kami membandingkan data yang dihiris di sepanjang paksi-X untuk isyarat yang muncul di rantau tanpa pertindihan yang ketara--kali ini memberi tumpuan kepada Fru H-3′.

Spektrum teratas dalam Rajah 12 menunjukkan spektrum ¹H konvensional, dan di bawahnya terdapat data hirisan yang diperoleh dengan masa pencampuran yang berbeza.
Seperti sebelumnya, kita mengambil Fru H-3′ sebagai titik permulaan geganti. Apabila masa pencampuran meningkat, korelasi dengan Fru H-4′, Fru H-5′, dan Fru H-6′ muncul, membolehkan kita mengesahkan sambungan dalam bahagian fruktosa.

Dengan cara ini, TOCSY membolehkan pemisahan rangkaian spin dalam sebatian yang mengandungi berbilang rangkaian spin. Dengan mengubah masa pencampuran, jarak dari permulaan juga boleh dinilai. ¹H. Walaupun spektrum COZY menjadi rumit, penggunaan TOCSY memberikan bantuan yang ketara dalam menentukan struktur molekul.

Contoh analisis glukosa menggunakan 1D TOCSY

1D TOCSY ialah versi satu dimensi bagi 2D TOCSY, dan prinsip asasnya adalah sama.
Walaupun TOCSY 2D digunakan untuk menganalisis rangkaian spin keseluruhan molekul, TOCSY 1D lebih berkesan apabila anda hanya ingin memeriksa sistem spin yang mana sesuatu molekul tertentu terlibat. ¹H tergolong. 1D TOCSY memerhatikan pemindahan kemagnetan--iaitu, geganti--daripada ¹H. Dengan meningkatkan masa pencampuran secara beransur-ansur, perambatan geganti kemagnetan di sepanjang rangkaian putaran dapat dijejaki. Untuk pengujaan terpilih, adalah lebih baik untuk memilih ¹H yang anjakan kimianya terpisah secukupnya daripada isyarat lain.
Satu lagi kelebihan pengukuran 1D ialah, berbanding pengukuran 2D, ia menawarkan resolusi digital yang lebih tinggi dan memudahkan untuk mengelakkan pertindihan isyarat.

Sekarang, mari kita tunjukkan satu contoh analisis glukosa.

Glukosa wujud dalam larutan akueus sebagai anomer α- dan β-. Oleh itu, ¹Spektrum H NMR ialah spektrum campuran α-glukosa dan β-glukosa, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 13. Untuk pengujaan terpilih bagi ¹Isyarat H, biasanya untuk dipilih ¹H muncul pada medan yang lebih rendah daripada yang lain (dalam kes gula, ¹H pada kedudukan anomerik). Hasil eksperimen TOCSY 1D dengan mengujakan anomerik secara selektif ¹H pada kedudukan 1 α-glukosa ditunjukkan dalam Rajah 14.

Dengan mengubah masa pencampuran dari 20 ms hingga 200 ms, adalah mungkin untuk mengesan rangkaian spin bermula dari anomerik ¹H pada kedudukan 1 α-glukosa sebagai titik geganti. Spektrum bawah dengan masa pencampuran 200 ms mewakili pengekstrakan hanya rangkaian spin α-glukosa daripada spektrum campuran α-glukosa dan β-glukosa. Tambahan pula, seperti yang dijelaskan sebelum ini, 1D TOCSY memberikan resolusi digital yang lebih baik daripada data hirisan 2D.
Oleh itu, 1D TOCSY lebih berkesan untuk mengekstrak dan mengesahkan sistem spin yang disambungkan melalui gandingan spin daripada spektrum yang sesak.
Adalah disyorkan untuk menggunakan 1D TOCSY dan 2D TOCSY dengan sewajarnya bergantung pada tujuannya.

Permohonan Berkaitan

Pemisahan spektroskopi bagi sebatian fluorin organik campuran oleh 2D ¹⁹F-¹⁹F TOCSY --Untuk mengekstrak 1D ¹⁹Spektrum F NMR bagi setiap sebatian--

Hubungi Kami

Jika anda berminat dengan analisis rangkaian spin menggunakan TOCSY atau HSQC-TOCSY, atau untuk maklumat lanjut tentang instrumen NMR, sila hubungi JEOL. Dengan pelbagai contoh aplikasi dan sokongan teknikal, kami akan menyokong analisis struktur molekul anda dengan sepenuhnya.

Produk