Asas NOE/NOESY: Punca dan Penyelesaian Apabila NOE Tidak Dikesan

NOE (Nuclear Overhauser Effect) ialah teknik pengukuran NMR yang penting yang boleh mendedahkan hubungan kedekatan ruang dalam molekul. Dalam lajur ini, kita membincangkan perbezaan antara perbezaan NOE, 1D NOESY, dan 2D NOESY, dan cara memilih setiap kaedah, masa kelonggaran yang penting untuk analisis. Punca dan penyelesaian untuk kes apabila NOE tidak dikesan juga dilindungi. Selain itu, kami menjawab soalan lazim dan menerangkan perkara utama untuk penggunaan pengukuran NOE yang berkesan.

Apakah ukuran NOE?

Pengukuran NOE(Nuclear Overhauser Effect) ialah satu kaedah untuk memerhati nukleus dalam jarak spatial yang dekat. Pengukuran NOE digunakan untuk mendapatkan stereokimia molekul, dan membezakan isomer dan mengesahkan lokasi kumpulan substituen, untuk penggunaan sebatian molekul kecil.

Prinsip NOE

NOE ialah fenomena di mana nukleus rapat secara spatial secara magnetik mempengaruhi satu sama lain dan menyebabkan perubahan keamatan isyarat NMR.

Memandangkan NOE, kita memikirkan dua proton dalam satu molekul seperti yang ditunjukkan dalam rajah di atas.
Apabila proton ini berdekatan antara satu sama lain, NOE diperhatikan kerana interaksi dipol.
Sebaliknya, jika jarak antara proton jauh, NOE tidak diperhatikan kerana tiada interaksi dipol.
Adalah diketahui bahawa interaksi dipol berkait rapat dengan jarak antara nuklear dan mobiliti molekul, dan jika jarak antara dua nukleus lebih pendek daripada 6 Å, NOE boleh diperhatikan.
Sebaliknya, kerana magnitud interaksi adalah berkadar dengan jarak antara nuklear (r) dengan kuasa keenam tolak (r-⁶), Apabila jarak antara nuklear meningkat, interaksi dengan cepat berkurangan, menjadikannya sukar untuk memerhati NOE.

Bagaimana untuk memerhati NOE

Berbeza daripada pemisahan dengan gandingan putaran, NOE tidak diperhatikan dengan spektrum NMR(1D, 2D NMR) yang telah kami perkenalkan setakat ini.
Oleh itu, langkah-langkah berikut diperlukan untuk pengukuran NOE.

• Menyinari gelombang radio kepada proton tertentu (pengujaan/tepu)

• Memerhati perubahan keamatan isyarat proton lain

• Menilai sama ada perubahan ini datang daripada NOE.

Jenis Pengukuran NOE

Terdapat tiga jenis ukuran NOE utama.

• Perbezaan NOE: perhatikan NOE keadaan mantap dengan mengambil perbezaan spektrum dengan dan tanpa penyinaran gelombang radio.

• 2D NOESY: amati NOE sementara dengan menggunakan spektrum 2D.

• NOESY 1D: merangsang proton secara selektif dan memerhati NOE sementara dalam satu dimensi.

NOE keadaan mantap adalah untuk menyinari gelombang radio untuk masa yang lama, membuat proton tepu tertentu, dan memerhati perubahan keamatan isyarat proton lain apabila keadaan tepu menjadi stabil.
NOE sementara diperhatikan semasa masa pencampuran selepas keadaan putaran diubah buat sementara waktu oleh penyinaran gelombang radio yang singkat.
Memandangkan mekanisme di mana NOE dijana adalah berbeza, syarat pengukuran bagi setiap kaedah mesti ditentukan dengan mengambil kira ciri setiap kaedah.

Pengukuran NOE Perbezaan

Pengukuran NOE Perbezaan ialah kaedah menyemak perubahan keamatan isyarat proton berdekatan dengan mengambil perbezaan antara spektrum proton tertentu apabila disinari dengan gelombang radio dan apabila tidak disinari dengan gelombang radio.

Seperti yang ditunjukkan di atas, dua proton, H_I dan H_S akan dipertimbangkan. H_I dan H_S berada dalam jarak spatial yang dekat dan mempunyai interaksi dipol.
(B) ialah ¹Spektrum H apabila H_S tidak disinari.

Di sini, apabila gelombang radio disinari ke H_S untuk mengenyangkan H_S, isyarat H_S menjadi tidak kelihatan. Pada masa ini, keamatan isyarat H_I menjadi besar disebabkan oleh interaksi dipol antara H_I dan H_S. Ini ialah "Perubahan disebabkan NOE".
Oleh kerana perubahan keamatan isyarat oleh NOE adalah sangat kecil, perbezaan antara (A) dan (B) dikira untuk membuat perbezaan yang jelas.
NOE yang diperhatikan dengan perbezaan NOE dipanggil "NOE keadaan mantap".
Secara amnya, untuk sebatian molekul kecil yang mempunyai pergerakan molekul berkelajuan tinggi dalam larutan, apabila perubahan isyarat proton yang disinari dinyatakan ke bawah, isyarat NOE diperhatikan sebagai isyarat menaik. Ini dipanggil "NOE Positif".

Contoh sebenar ukuran NOE perbezaan diperkenalkan, dengan menggunakan etil crotonate.

Kami ingin menentukan sama ada konformasi ikatan berganda adalah cis atau trans dengan menggunakan ukuran NOE perbezaan. Proton kumpulan metil yang dinyatakan sebagai A disinari, dan NOE yang berkaitan diperhatikan.

Di bahagian atas rajah di atas, ¹Spektrum H etil crotonate ditunjukkan.
Di bahagian bawah, perbezaan spektrum NOE apabila proton kumpulan metil di A tepu, ditunjukkan.
Data ini diukur dengan menggunakan instrumen 400 MHz dan isyarat NOE diperhatikan ke atas pada B dan C.

Berdasarkan keputusan yang diperoleh, penyinaran proton kumpulan metil di A membawa kepada NOE yang boleh diperhatikan di B dan C, menunjukkan bahawa etil crotonate mempunyai konformasi trans.

1D NOESY

1D NOESY ialah kaedah untuk merangsang proton tertentu secara selektif dan memerhati NOE sementara antara proton tertentu dan proton lain yang berdekatan secara ruang sebagai spektrum satu dimensi.
Dalam pengukuran ini, nadi lembut (nadi lebar jalur sempit) dan kecerunan medan berdenyut digunakan untuk merangsang hanya proton yang diminati, dan perubahan dalam NOE sepanjang masa pencampuran direkodkan.
Oleh kerana tidak perlu menolak spektrum seperti dalam perbezaan NOE, spektrum yang mudah dianalisis diperolehi.
1D NOESY sesuai apabila anda mempunyai proton tertentu yang diminati atau apabila anda ingin menyemak NOE dengan cara yang mudah.

Di sini, kami membentangkan contoh ukuran NOESY 1D menggunakan etil crotonate. (B) dalam rajah di atas menunjukkan spektrum NOESY 1D yang diperolehi oleh pengujaan terpilih proton A, manakala (C) menunjukkan spektrum yang diperolehi oleh pengujaan terpilih proton C.
Tidak seperti perbezaan spektrum NOE, 1D NOESY tidak menunjukkan isyarat sisa yang disebabkan oleh penolakan dua spektrum yang diperoleh sebelum dan selepas penyinaran gelombang radio, menjadikan spektrum lebih mudah untuk dianalisis.

Kaedah tafsiran adalah serupa dengan perbezaan NOE: kami menyemak bagaimana isyarat lain muncul apabila isyarat proton teruja terpilih ditunjukkan ke bawah.
Dalam contoh etil crotonate, apabila proton A teruja secara selektif, NOE positif diperhatikan pada B dan C. Sebaliknya, apabila proton C teruja, NOE positif diperhatikan hanya pada A. Keputusan ini juga menyokong anggaran bahawa etil crotonate mempunyai stereokimia jenis trans.
Oleh itu, apabila menentukan stereokimia dengan susunan ruang yang tidak jelas, adalah penting untuk mengukur NOESY 1D bagi pengujaan terpilih bagi setiap bahagian .

2D NOESY

2D NOESY ialah kaedah untuk memerhati interaksi (NOE) antara proton rapat secara ruang dalam molekul sebagai spektrum dua dimensi.
Eksperimen ini memerhatikan rupa bagaimana NOE berubah (NOE sementara) semasa masa pencampuran selepas menukar keadaan putaran proton buat sementara waktu.
Spektrum yang diperolehi menyatakan isyarat diri pada isyarat pepenjuru dan berkorelasi antara proton rapat secara ruang.
Memandangkan NOESY 2D membenarkan korelasi NOE komprehensif dalam keseluruhan molekul, ia sesuai untuk analisis struktur rumit dan pengesahan keseluruhan penugasan isyarat.

Dari sini, kami akan menerangkan cara membaca spektrum NOESY 2D. Seperti yang ditunjukkan dalam rajah di atas, apabila A dan C, B dan D berada dalam jarak yang dekat antara satu sama lain, isyarat korelasi tersebut muncul.
Data yang dihiris pada kedudukan A dan B (dalam garis putus-putus biru) dalam arah paksi X, adalah bersamaan dengan spektrum NOESY 1D oleh pengujaan terpilih A dan B masing-masing.

Angka ini menunjukkan NOESY 2D bagi etil crotonate.
Melihat pada setiap data yang dihiris, isyarat pada bahagian teruja terpilih (berwarna merah) kelihatan ke bawah, manakala isyarat dengan korelasi NOE (dalam hitam) muncul ke atas (NOE positif).
Apabila melihat isyarat korelasi dalam warna hitam, korelasi NOE berikut boleh didapati.

A：B dan C
B：A
C：A
D：E
E：D

Di samping itu, memfokuskan pada korelasi NOE antara A, B, dan C, keputusan menyokong kehadiran konformasi jenis trans, selaras dengan perbezaan keputusan NOE dan 1D NOESY yang dinyatakan sebelum ini.

Garis panduan mudah dalam memilih kaedah pengukuran NOE

Seperti yang telah kami jelaskan, untuk pengukuran NOE, adalah mungkin untuk memilih kaedah mengikut tujuan.
Kami mengesyorkan anda bermula dengan 1D NOESY yang membolehkan penetapan keadaan mudah dan spektrum yang jelas diperolehi.
-----
Sasaran proton telah ditentukan: pengukuran 1D
Ingin melihat NOE merentasi molekul, atau penetapan isyarat tidak pasti: 2D NOESY
-----

Faktor penting untuk pengukuran NOE：Masa berehat

Salah satu masalah yang paling mengecewakan dalam pengukuran NOE adalah, tanpa keraguan, "apabila tiada isyarat NOE dikesan!"
Dalam kes sedemikian, sila ukur masa kelonggaran membujur (T₁) daripada sampel sasaran, pertama.
Kemudian, untuk ukuran NOE perbezaan, sila tetapkan masa penyinaran nadi pengujaan menjadi lebih daripada 5 kali ganda daripada T₁ daripada sampel sasaran.
Juga, sila tetapkan masa pencampuran dengan 1D/2D-NOESY, kira-kira 0.8 kali ganda daripada T₁ daripada sampel sasaran.

Sekarang, mengapa kita perlu mempertimbangkan masa kelonggaran sampel sasaran, untuk pengukuran NOE?
Ini kerana NOE mempunyai hubungan yang mendalam dengan masa kelonggaran, kerana NOE adalah fenomena kelonggaran berdasarkan interaksi dipol.

Di sini, kami ingin memberikan penjelasan ringkas tentang kelonggaran di NMR.

Di atas ialah gambarajah skema tahap tenaga putaran nuklear nombor putaran= 1/2 apabila ia
diletakkan dalam medan magnet statik. Putaran nuklear mengambil dua keadaan tenaga selepas mengalami pembelahan Zeeman dengan dipengaruhi oleh medan magnet.
Keadaan stabil dengan tenaga rendah dipanggil keadaan α, manakala keadaan tenaga tinggi dipanggil keadaan β.
Apabila gelombang radio yang mempunyai frekuensi yang setara dengan jurang tenaga ini disinari, putaran dalam keadaan α menyerap tenaga gelombang radio dan teruja ke dalam keadaan β.
Apabila nombor putaran keadaan α dan keadaan β menjadi sama dengan penyinaran gelombang radio, penyerapan tenaga berhenti, yang dipanggil keadaan tepu.
Dalam keadaan tepu, putaran dalam keadaan β memancarkan tenaga dan kembali ke keadaan α, akhirnya, ia juga kembali ke keadaan seimbang terma. Seluruh proses dipanggil kelonggaran.
Kemudian, satu siri proses daripada pengujaan kepada kelonggaran, dipanggil fenomena NMR yang kita perhatikan.

Interaksi berfungsi antara dua putaran nuklear yang berjiran, yang merupakan daya penggerak untuk kelonggaran yang dijelaskan sebelum ini. Dalam larutan NMR, interaksi dipol adalah salah satu faktor utama dalam menggalakkan kelonggaran. Oleh itu, menetapkan parameter masa kelonggaran yang mempunyai hubungan yang mendalam dengan interaksi dipol adalah kunci penting untuk pemerhatian NOE yang berjaya.

Punca dan penyelesaian untuk isyarat NOE yang tidak dapat dikesan

Kemungkinan punca dan tindakan apabila NOE tidak dikesan, dijelaskan dalam 4 perkara berikut.

• Optimumkan keadaan pelarasan/pengukuran sampel

• Tukar gerakan molekul

• Tukar kekerapan resonans

• Ubah kaedah pengukuran

Mula-mula, semak jika 1. dioptimumkan, dan jika NOE tidak dipatuhi, cuba 2 hingga 4.

1. Optimumkan keadaan pelarasan/pengukuran sampel

Oleh kerana isyarat NOE sangat lemah, hasilnya sangat dipengaruhi oleh kepekatan sampel dan ketulenan, dan tetapan keadaan pengukuran.

• Kepekatan: jika kepekatan terlalu tinggi, kelonggaran cenderung berlaku di antara molekul, melemahkan NOE.

• Berhati-hati terhadap pencemaran bahan paramagnet: oksigen terlarut dan ion logam (Fe, Cu, et_C.) menggalakkan kelonggaran, dengan itu menghalang NOE.

• Penetapan masa penyinaran/pencampuran: Berdasarkan T₁(masa kelonggaran membujur), masa penyinaran lebih daripada 5 kali, masa pencampuran kira-kira 0.8 kali adalah garis panduan.

2. Tukar gerakan molekul

Keamatan NOE juga bergantung kepada gerakan molekul.
Graf berikut menunjukkan hubungan antara keamatan NOE dan gerakan molekul.

Keluk ini secara teorinya dibawa daripada ungkapan hubungan intensiti NOE dan interaksi dipol.

Paksi menegak menyatakan keamatan NOE, manakala paksi mendatar menyatakan hasil darab kekerapan pemerhatian ω didarab dengan masa korelasi molekul t_C.
t_C ialah masa yang diperlukan untuk molekul membuat putaran penuh dalam larutan dan merupakan parameter yang menyatakan gerakan molekul. Maksudnya, semakin kecil molekul, semakin pendek t_C menjadi. Semakin besar molekul, semakin panjang t_C menjadi.

Kiri menunjukkan kawasan molekul rendah di mana t_C adalah pendek dan pergerakan molekul adalah pantas. Di sini, NOE positif diperhatikan.
Sebaliknya, sebelah kanan menunjukkan kawasan polimer di mana t_C panjang dan pergerakan molekulnya perlahan. Di sini, NOE negatif diperhatikan. Maksudnya, graf menunjukkan bahawa keamatan NOE sangat berubah bergantung pada gerakan molekul.

Apa yang penting dalam melakukan pengukuran ialah terdapat kawasan di mana NOE menjadi sifar.
Apabila molekul hampir dengan kawasan di mana hasil darab frekuensi cerapan ω dan masa korelasi molekul t_C ialah 1, NOE menjadi sangat lemah atau NOE tidak diperhatikan.

Oleh itu, jika NOE tidak boleh diperhatikan walaupun keadaan pengukuran disemak dengan instrumen anda, ada kemungkinan hasil darab frekuensi cerapan ω dan masa korelasi molekul t_C berada di wilayah ini.

Dalam kes sedemikian, menukar ω atau t_C adalah pilihan yang mungkin.
Walau bagaimanapun, menukar ω bermakna menukar medan magnet pengukuran, dan mungkin sukar untuk mencubanya sekaligus jika anda memegang hanya satu instrumen.
Oleh itu, kami mencadangkan agar anda mempertimbangkan untuk menukar t_C , iaitu mengubah faktor yang boleh mempengaruhi t_C(suhu pengukuran dan kelikatan pelarut).
Kami mengesyorkan anda menukar suhu pengukuran, terlebih dahulu.

3. Tukar kekerapan resonans

Seterusnya, saya akan menerangkan kes di mana kekerapan pemerhatian diubah, iaitu, di mana medan magnet pengukuran diubah.

Rajah di atas menunjukkan pergantungan medan magnet keamatan NOE dan masa korelasi t_C .Paksi menegak mewakili keamatan NOE, manakala paksi mendatar mewakili masa korelasi t_C. Setiap lengkung sepadan dengan medan magnet dari 90 MHz hingga 920 MHz. Lengkung beralih ke kiri apabila medan magnet pengukuran meningkat. Jika kita memberi tumpuan kepada t_C di mana NOE menjadi sifar, kita dapat melihat bahawa titik di mana keamatan isyarat menjadi sifar beralih ke kawasan molekul rendah (di mana molekul berada dalam gerakan pantas) apabila medan magnet meningkat.
Ini bermakna di bawah keadaan pengukuran yang sama, keamatan isyarat NOE positif menjadi lebih lemah pada medan magnet yang lebih tinggi. Sebagai contoh, boleh dikatakan bahawa molekul dengan NOE sifar dalam instrumen 600 MHz mungkin mempunyai NOE positif yang diperhatikan dalam instrumen 300 MHz. Di samping itu, untuk kes molekul dengan kira-kira 1000 berat molekul, kemungkinan besar ia boleh berada di kawasan dalam bulatan di mana NOE adalah sangat kecil, jadi perhatian diperlukan.

4. Tukar kaedah pengukuran

Jika NOE tidak diperhatikan selepas mencuba kaedah 1 hingga 3 diperkenalkan setakat ini, kaedah pengukuran dipanggil ROESY digunakan. ROESY ialah ukuran NOE dalam sistem koordinat putaran.

Rajah di atas ialah spektrum 1D NOESY dan 1D ROESY gramicidin S diukur pada 90°C.
Pada suhu ini, NOE gramicidin S menjadi hampir sifar, tetapi menggunakan ROESY membolehkan pemerhatian isyarat korelasi. NOE yang diperhatikan dalam ROESY dirujuk sebagai ROE. Kelebihan terbesar ROESY ialah, seperti yang digambarkan dalam rajah skematik, ROE sentiasa positif dan tidak mempunyai rantau sifar.
Anda mungkin tertanya-tanya, "Kalau begitu, mengapa tidak menggunakan ROESY sahaja dari awal?" Walau bagaimanapun, ROESY memerlukan tetapan parameter yang lebih berhati-hati dan cenderung untuk menghasilkan isyarat yang tidak diingini. Oleh itu, ROESY lebih baik digunakan apabila NOESY tidak berfungsi dengan baik.

Soalan Lazim tentang Pengukuran NOE

• Bentuk perbezaan isyarat NOE kelihatan pelik!!

  Dalam perbezaan ukuran NOE, jika kedudukan penyinaran tidak ditetapkan pada maksimum puncak, kesan gandingan putaran boleh berlaku, menyebabkan perubahan dalam bentuk isyarat. Oleh itu, kedudukan penyinaran hendaklah ditetapkan dengan tepat pada maksimum puncak.

  

  Dalam ukuran NOE perbezaan, apabila gandaan lebih daripada berganda disinari secara selektif dan jika kedudukan penyinaran dialihkan daripada maksimum puncak, bentuk isyarat ditukar. Kedua-dua spektrum di atas menunjukkan perbezaan keputusan NOE apabila proton kumpulan metil etil crotonate disinari. Isyarat NOE positif diperhatikan pada B dan C. Jika kedudukan penyinaran dianjak ke sekitar ppm tengah isyarat A dan bukannya maksimum puncak, isyarat besar, tidak simetri, seperti baki muncul, seperti yang ditunjukkan dalam kawasan bertitik spektrum atas. Ini disebabkan oleh interaksi gandingan putaran dengan proton B. Sentiasa pilih kedudukan penyinaran pada maksimum puncak dalam ukuran NOE perbezaan.

• Mengapakah molekul kecil menunjukkan NOE negatif?

  Fenomena ini dikenali sebagai NOE tidak langsung (kesan tiga putaran), dan dalam molekul kecil, ia boleh diperhatikan apabila proton disusun hampir secara linear.

  

  Biasanya, molekul kecil yang mengalami gerakan pantas dalam larutan mempamerkan isyarat NOE positif. Walau bagaimanapun, isyarat kadangkala mungkin muncul dalam arah yang sama dengan NOE negatif. Sebagai contoh, pertimbangkan susunan ruang yang ditunjukkan dalam rajah di sebelah kiri, di mana proton AB, dan BC adalah rapat dari segi ruang, tetapi AC berjauhan. Rajah di sebelah kanan menunjukkan spektrum NOESY 1D apabila proton A teruja secara selektif. Oleh kerana A dan B adalah hampir, NOE positif diperhatikan pada B. Walau bagaimanapun, NOE tidak langsung mungkin juga muncul di C melalui B. NOE tidak langsung ini muncul dalam arah yang bertentangan dengan NOE positif. Adalah penting untuk ambil perhatian bahawa isyarat ini tidak menunjukkan bahawa AC adalah rapat dari segi ruang. Fenomena ini berkemungkinan besar berlaku apabila tiga proton disusun hampir secara linear di angkasa, dan ia dikenali sebagai "kesan tiga putaran."

• Mengapa NOE tidak tersedia, walaupun jaraknya sepatutnya dekat?

  Apabila, tiga proton disusun secara spatial istimewa, NOE mungkin tidak diperhatikan walaupun jaraknya dekat.

  

  Sebagai kes khas bagi kesan tiga putaran, izinkan saya menerangkan masalah segi tiga. Seperti yang ditunjukkan dalam rajah di atas, apabila tiga proton disusun secara spatial istimewa, masalah ini boleh berlaku.

  

  Apabila A teruja secara selektif, bukan sahaja jarak antara A dan B, tetapi juga A dan C adalah dekat. Oleh itu, NOE positif sepatutnya dilihat antara A dan C, spektrum yang diramalkan adalah betul dalam rajah di atas.

  

  Walau bagaimanapun, NOE positif dari A hingga C ditunjukkan dalam oren dan NOE tidak langsung melalui B ditunjukkan dalam warna hijau boleh membatalkan satu sama lain, menyebabkan NOE tidak boleh diperhatikan.
  Secara teorinya, pembatalan ini berlaku apabila nisbah jarak antara setiap pasangan proton ialah 1:1:1.26. Dalam erti kata lain, walaupun proton rapat dari segi ruang, NOE mungkin tidak diperhatikan.

Rujukan

Claridge, DWT(2004), *Yūki kagaku no tame no kōbun Kainou NMR tekunikku* [Teknik NMR resolusi tinggi untuk kimia organik](T.Takeuchi & M. Nishikawa(Trans.) Kodansha Scientific.

Fukushi, E.&Sohmiya H.(2007), *Korenara wakaru nijigen NMR* [Memahami NMR 2D menjadi mudah]. Kagaku Dojin.

Permohonan Berkaitan

Pemerhatian NOE oleh HSQC-NOESY

Hubungi Kami

Jika anda berminat untuk menyelidik menggunakan NOE atau butiran tentang spektrometer NMR, sila hubungi JEOL. Dengan pelbagai contoh aplikasi dan sokongan teknikal, kami sangat menyokong usaha penyelidikan anda.

Produk